疟原虫核酸检测技术建立及在献血员筛查应用的研究

目的建立血液中疟原虫检测的核酸技术，探讨应用于献血员筛查的效果。方法根据红细胞内期疟原虫ssurRNA编码基因序列，设计合成三条扩增引物。将5份待检血样混合，采用蛋白酶K消化裂解法制备模板，在同一反应体系中扩增恶性疟原虫和间日疟原虫DNA，诊断鉴别恶性疟和间日疟。与厚血膜镜检法比较评价其灵敏度及特异性。结果将3份恶性疟原虫及10份间日疟原虫感染者的血样随机混入5000份无偿献血者血样中，每5份为一个检测单元，采用PCR方法从感染血样中扩增出分别为436bp和341bp的恶性疟原虫及间日疟原虫特异性的DNA片段，并经序列测定证实扩增片段的正确性；10份间日疟患者血样以及3份恶性疟患者血样均被检出，献血者血样PCR检测结果均为阴性，结果与厚血膜方法完全一致。结论所建立的疟原虫核酸检测技术灵敏度高、特异性好，且可以批量处理，提高了检测的效率，能有效降低疟原虫的输血传播，具有很好的推广使用价值。     

ABO血型基因转录结构的研究及应用

目的 建立研究ABO血型系统基因转录结构的方法.方法 使用两套RNA逆转录-巢式PCR-序列测定的反应策略对中国人群6种常见ABO基因型的11个血液标本转录结构进行分析.应用所建立的方法对3例ABO血型正反定型不符的标本进行ABO基因转录结构的分析.结果 未能检测到O基因的转录结构;两套PCR策略均发现有2种转录结构,一种是完整的ABO基因编码区,另一种是缺失了整个第6外显子的ABO基因编码序列.一个变异的ABO等位基因在Bx表型个体被发现.结论 ABO基因转录结构的剪切方式是复杂的,不同剪切位点的ABO转录子被观察到.O等位基因的转录结构在RT-PCR分析未检测出来.O型基因转录结构这个特点的发现,可以应用于ABO基因单倍体序列测定中.     

五例样本HLA-C基因测序分型中等位基因丢失及其原因分析

目的 探讨HLA-C基因测序分型时等位基因漏检和丢失的原因,以提高HLA测序分型的成功率和准确性.方法 620份随机选择的深圳健康捐血者血样,采用AlleleSEQR HLA-C plus测序分型试剂盒进行检测,对无完全匹配、分型结果"异常"的标本,采用分子克隆和测序方法进行全长单倍体序列分析;对未检出新的碱基点突变的样本,进一步采用自行设计的PCR引物和AlleleSEQR试剂盒中的测序引物进行再测序,分析测序分型结果"异常"的原因.结果 620份经AlleleSEQR HLA-C测序分型的样本中,发现5例样本无完全匹配的基因型,与之最接近的多种等位基因型均存在单个碱基的不匹配;并且在第4外显子出现碱基杂合,但第2和第3外显子区域内无杂合碱基.经分子克隆和单倍体测序,以及采用自行设计的PCR引物和AlleleSEQR试剂盒中的测序引物再测序,证实了5例标本均存在Cw * 0706等位基因漏检和丢失现象,未发现新的碱基点突变.结论 HLA-C基因测序分型时,因PCR引物与模板DNA不匹配会导致等位基因的漏检和丢失.根据中国人群HLA-C分子全长序列特点,开发适合于中国人群的测序分型试剂十分必要.     

壮族非亲缘男性个体中9个短片段Y-STR基因座遗传多态性的研究

本研究探讨中国最大少数民族壮族Y染色体特异短串联重复序列（Y-STR）单倍型的遗传多态性。采用多重PCR扩增和ABIPrism^TM3100基因测序仪荧光检测方法，对85名壮族非亲缘男性个体的9个短片段长度Y—STR基因座，进行基因频率和单倍型频率的调查。结果表明：在85名非亲缘男性个体中，除DYS426基因座多态性较低，其余8个基因座的GD值的分布在0．4387—0．8129之间。9个Y—STR基因座的单倍型共有70种．单倍型多样性达0．9926。结论：壮族非亲缘男性个体Y—STR单倍型的遗传多态性丰富，与我们以往的南方汉族非亲缘男性群体遗传资料相比较，具有显著的差异。     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

中国人群Auberger抗原基因多态性研究

目的 对中国人群Latheran血型系统中Auberger抗原的摹因多态性分布进行研究,建立起稳定、准确的Auberger抗原分子生物学的检测方法.方法 随机采集162名非血缘关系无偿志愿捐血者外周血样,直接进行Auberger血型抗原基因的第12外显子测序分析.对新位点突变应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法电泳分析.结果 在162人份标本中Aua+b-(nt 1615A)119人,Aua+b(nt 1615A/G)40人,Aua-b+(nt 1615c)3人,Aua和Aub的基因频率分别为0.8580和0.1420.在1例基因为Aua纯合型个体中,出现nt1595G＞T突变,PCR产物经Hha Ⅰ限制性内切酶内切后,突变型和野生型的个体分别被分为不同片段,可证实该突变存在.结论 建立起Auberger抗原分子生物学的检测方法,得到中国人群Auberger抗原基因的多态性分布,发现一个新的Lutheran等位基因(GenBank注册号:EU2N1043).     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.     

HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法的建立

目的 建立可靠的HLA-Cw基因全长序列的分子克隆和测序技术.方法 设计合成HLA-Cw基因全长序列PCR引物和探索PCR反应体系,采用长距离PCR技术,扩增HLA-Cw基因非翻泽区(untranslated region,5'-UTR)区、8个外显子、7个内含子和3'-UTR区,全长约4.5 kb.PCR产物纯化后进行分子克隆,筛选阳性克隆,提取质粒DNA,采用自行设计的测序引物进行全长双向测序.12份已经AlleleSEQR HLA-Cw测序分型试剂盒进行PCR产物直接测序、基因型已知的样本,分别用TaKaRa LATaq酶和Stratagene Pfu Taq DNA聚合酶进行HLA-Cw基因全长扩增,以及PCR产物分子克隆和序列测定,克隆测序结果分别与PCR产物直接测序结果进行对比分析.结果 PCR扩增获得了特异性目的 片段,测序获得了HLA-Cw基因-962～3576位碱基全长序列.克隆测序结果的对比表明,Pfu酶保真性高于LA Taq酶.比较本文测定的Cw*010201与Cw*07020101等位基因序列,在5'上游-962～-284位碱基区域存在11个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms,SNPs)和2个插入(或)缺失多态性位点;3'-UTR下游3067～3576位碱基区域存在11个SNPs和1个插入(或)缺失.结论 建立了HLA-Cw基因全长序列分子克隆及测序方法,在HLA-Cw基因全长序列分子多态性及表达调控等研究领域,具有广泛应用前景.