PCR技术检测的质控问题经验谈

ＰＣＲ技术检测的质控问题经验谈丁柳秦山华西医科大学附属第一医院传染科聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是一种选择性体外扩增核酸片段的方法，自从１９８４年Ｍｕｌｉｓ发明该技术后，取得了突飞猛进的发展，已在临床检测如感...     

亲和ELISA法和溶血带形分析法对风疹病毒疫苗免疫后抗体IgG亲和力成熟变化的研究

风疹疫苗免疫后抗体成熟变化采用两种方法研究，亲和力—酶联免疫吸附（Avidity—ELISA）定量试验法以抗原洗提特征来区分风疹病毒的初次感染和以往已感染；溶血带形分析法（半定量分析法），在放射状溶血试验中，以溶血带形的差异来区分风疹—IgG抗体亲和力的高低。用上述二法对两株（Cendhill或RA27／3）减毒风疹病毒免疫接种前后所采集的血清作了研究，发现初次免疫接种风疹病毒后头2月中合成的IgG，其亲和力极低；随后4个月中合成的亲和力明显上升；在免疫后第6～12个月中合成的IgG，其亲和力不明显。与此相反，以往接受过免疫接种者，其IgG亲和力一直维持起始的高水平。这些结果提示判断风疹病毒的近期初次感染或免疫疫苗的接种反应的依据，特异IgG亲和力也可将其与风疹病毒再感染相区别。     

HBV DNA检测阳性病人其血清学模式分析

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)感染的血清标志物是目前临床诊断乙肝病毒感染和观察治疗效果的重要指标;随着分子生物学技术的发展,聚合酶链反应技术(PCR)被广泛应用,对HBV感染的诊断已从免疫学检测发展到核酸检测水平,患者血清的HBV DNA定量测定对临床诊疗及预后判断均具有重要意义。本研究采用HBV DNA荧光定量PCR和酶联免疫(ELISA)对2943份检测阳性的病人中血清学标志物常见模式分布情况,及HBV DNA拷贝数与血清学模式之间的关系。探讨两种检测方法之间的相关关系、及荧光定量PCR技术检测乙肝病毒DNA的临床意义。…     

阴沟肠杆菌纸片扩散药敏试验中抑菌环内菌落分析

目的分析阴沟肠杆菌纸片扩散药敏试验中头孢菌素抑菌环内菌落出现原因，并为纸片法药敏结果正确解释提供依据。方法从药物敏感性、β内酰胺酶等电点、诱导性和染色体DNA指纹图等方面对抑菌环内菌落和其原始株进行分析、比较。结果25／35株临床分离阴沟肠杆菌在头孢菌素抑菌环内出现小菌落。抑菌环内菌落分析显示，17株属AmpC β内酰胺酶完全去抑制突变个体，8株属部分去抑制突变个体。结论阴沟肠杆菌纸片扩散药敏试验中头孢菌素抑菌环内菌落是其去抑制突变而高产AmpC β内酰胺酶个体。医院感染中的阴沟肠杆菌是一个在药物敏感性上存在异源性的群体。对其抑菌环内出现耐药菌落，在排除污染后，应解释为耐药。     

体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因—ｎｅｏｒ基因的质粒ｐＳＶ２ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株—Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５Ｓ细胞。斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５Ｓ细胞可作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ的靶细胞。进一步对Ｐ８１５Ｓ细胞成功地进行５１Ｃｒ标记，以及标记靶细胞５１Ｃｒ最大释放值和自然释放值的测定表明：利用５１Ｃｒ释放法体外检测近交系小鼠（ＢＡＬＢ／Ｃ）ＨＢｓＡｇ特异性ＣＴＬ功能的方法被建立。     

非淋菌性尿道炎在性传播疾病中变化的研究

目的检测性传播疾病(STD)患者尿道分泌物中淋球菌(NG)、沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)的DNA在STD中的比例。方法利用实时荧光定量PCR方法,检测1 239例性传播疾病患者。结果经统计发现:(1)非淋菌性尿道炎(NGU)发病率越来越高,比淋球菌(NG)感染高4.3倍。(2)解脲支原体(UU)的发病率高出沙眼衣原体(CT)4.4倍。结论非淋菌性尿道炎(NGU)已成为发病最多的STD,而解脲支原体(UU)成为NGU中最主要的致病因素。     

国产血源乙肝疫苗0、l、2月免疫接种新方案效果初步观察

我国人群中HBsAg携带率达5~20%,这对健康人群形成了很大威胁,尤其是学龄前儿童的HBV易感率可达80%．使用乙肝疫苗主动免疫是控制和预防乙肝病毒感染的主要手段,现国内普遍采用乙肝疫苗接种方案为0、l、6月3次注射法,第2次注射后的抗-HDs阳转率只能达到60%左右,待4个月完成第3针后才能达到70~90%。由于完成全程免疫的时间太长,推迟了接种者抗－HBs水平的产生,不能及时得到保护,同时对乙肝疫苗的保存带来不便。本文为健康儿童及成人共113例乙肝疫苗接种者设计了10μg/次,0、l、2月3次注射新方案,男83例儿童和成人仍按o、l、6月方案接种对照,对缩短免疫时间后的免疫应答效果及安全性进行观察。     

3种RNA提取方法在血清丙型肝炎病毒RNA定量检测中的性能评价

目的 比较3种方法对血清HCV RNA的提取性能,并对其作方法学评价,揭示RNA提取技术对HCVRNA定量的影响.方法 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Q法),NucliSens miniMag系统(M法)和匹基(PG)丙型肝炎病毒定量试剂盒自带RNA提取方法(P法)进行血清HCV RNA提取,实时荧光RT PCR定量检测,对77例临床血清标本进行了提取检测,同时设计了方法学评价实验,从准确度,重复性,线性和灵敏度方面评价3种方法.结果 77例临床标本的M、Q和P法阳性率分别是85.7%、84.4%和36.3%;25例共同阳性标本中,M和Q法的CT值分别比P法平均低7.5和9.35,表现出高于P法的提取效率和RNA质量;M和Q法的标准变异指数(S.D.I.)绝对值均<2,P法S.D.I.绝对值>2;M法平均CV为40.0%,Q法为71.0%,P法>100.0%;M法表现最佳的线性(R>0.99),M、Q和P法的最低检测限分别为39.4、394和3943 IU/ml.结论 从提取效率和收获RNA质量上M和Q法远远优于P法,进一步方法性能表明,M法为HCV RNA定量最佳提取方法,而P法因其提取效率低、收获RNA质量差以及重复性不好,不适合临床HCV RNA定量试验.     

荧光定量检测HBV DNA与乙肝两对半结果对比分析研究

目的为了对乙肝患者体内HBV复制及传染性有更直接地了解,亦更有利于对临床HBV感染的诊断、治疗方案的选择及疗效判定.方法运用荧光定量PCR(FQ-PCR)和ELISA两种方法同时检测了310份肝炎患者血清,并对结果进行了对比分析.结果乙肝大三阳患者血清HBV DNA检出率为92.5%(74/80),平均拷贝数为4.10×1010/ml;小三阳患者血清HBV DNA检出率为32.35%(22/68),平均拷贝数为1.31×109/ml;HBsAg(+)、HBcAb(+)组血清HBV DNA检出率为45.71%(32/70),平均考贝数为4.08×108ml;HBV-M全阴性组血清HBV DNA检出率仍达6.67%(2/32),平均拷贝数仍达1.54×108/ml.结论HBV-M阴性患者仍有HBV DNA阳性者,因此对临床HBV感染、复制及传染性的判断以及指导治疗,除乙肝二对半标志物ELISA检测外,加做HBV DNA FQ-PCR检测同样具有重要意义.     

成都地区汉族人群9个STR基因座遗传多态性的研究

目的 时成都汉族D3S1358、vWA、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317及D7S820等9个STB基因座的遗传多态性进行群体遗传学研究.方法利用荧光标记复合扩增及毛细管电泳自动荧光检测的方法,对260名无关个体获得9个STR基因座等位基因的分布频率等群体遗传学数据.结果 D3S1358、vWA、FGA、DSS1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317及D7S820等9个基因座上分别检出等位基因6、9、12、9、17、15、9、8和9个.杂合度分别为:0.812、0.808、0.842、0.731、0.673、0.796、0.788、0.800和0.777;多态信息量为:0.830、0.800、0.850、0.750、0.680、0.750、0.770、0.840和O.760;个体识别率为:0.958、0.945、0.965、0.919、0.882、0.913、0.930、0.961和0.927;非父排除率为:0.621、0.613、0.680、0.477、0.388、0.592、0.578、0.599和0.577.9个STR基因座均符合Hardy-Weinberg平衡.结论 这9个STR基因座多态性好,灵敏度高,可用于人类遗传分析及法医学中的亲子鉴定和个人识则.