人重组胱天蛋白酶原-3的表达和体外活化

目的:建立一个在短时间内获取大量活化胱天蛋白酶-3的方法.方法:将胱天蛋白酶-3酶原的基因从真核表达载体中克隆到原核表达载体pMTY4-His中,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达MS2-胱天蛋白酶原-3融合蛋白;将包涵体变性,经酸化和浓缩进行体外活化;对所得蛋白用Western blot和活性试验进行鉴定.结果:构建成pMTY4-His-胱天蛋白酶-3原核表达载体,在大肠杆菌中获得了较高水平表达的胱天蛋白酶原-3酶原-MS2融合蛋白.体外活化后每升诱导菌可获得约10 mg蛋白,用抗胱天蛋白酶-3单克隆抗体证实所得蛋白为胱天蛋白酶原-3,活性试验证实得到高活性的蛋白.结论: 成功地建立了大量获取高活性的胱天蛋白酶-3的方法,为深入研究胱天蛋白酶-3的功能和性质提供物质基础.     

CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件

目的：探讨CKLF基因与CKLFSF1基因间序列(CCS)的调控作用。方法：运用PCR技术扩增CCS，并将此片段插入含有荧光素酶(luriferase)报告基因载体pGL3-basic，以及pGL3-SV40启动子中，构建受其调控的荧光素酶报告基因载体。应用脂质体介导基因转染技术，将4种重组质粒转染Hela细胞，进行瞬时表达分析。结果：在pGL3-basic和pGL3-basic-CCS质粒中的报告基因luciferase均无表达，但将CCS片段插入至promoter上游后，荧光素酶活性增加近1倍。结论：CKLF与CKLFSF1基因间的序列不具有启动子活性，但该序列中却可能存在调控其下游基因表达的顺式增强子元件。     

52000Ro/SSA抗原结构分析及抗原片段克隆

目的 预测相对分子量为52000的Ro/SSA自身抗原的可能表位,并选择性克隆含亮氨酸拉链氨基酸序列的抗原片段。方法 用蛋白结构分析软件对52000Ro/SSA抗原结构进行分析,从人心脏来源的cDNA中通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到编码第119至264位氨基酸片段的cDNA,插入表达载体,转染大肠杆菌并表达融合蛋白。结果 计算机分析显示该抗原中有α螺旋结构,整个分子抗原性强,柔韧性一般,表面可及性差。PCR产物长440bp,重组融合蛋白相对分子质量为28000,测序鉴定保证了研究的正确性。结论 52000Ro/SSA多肽抗原性好,所获得的抗原片段为今后研究亮氨酸拉链氨基酸序列在该抗原表位形成中的作用奠定了基础。     

大鼠趋化素样因子对成肌细胞促增殖作用的研究

目的 探讨大鼠趋化素样因子1和2（rCKLF1，2）对成肌细胞的增殖促进作用。方法 构建pcDNA3.1/rCKLF1和pcDNA3.1/rCKLF2真核表达载体，并瞬时转染293T细胞，收获培养上清，分别以^3H-TdR掺入和MTT比色法，分析rCKLF1和rCKLF2对小鼠肌母细胞系C2C12和原代肌卫星细胞增殖的促进作用，结果 成功地构建了rCKLF1和rCKLF2的真核表达质粒，并在SV40转化的293T细胞中瞬时表达rCKLF1和rCKLF2，瞬时转染上清能够使C2C12细胞的^3H-TdR的掺入值增加2倍或3倍，MTT比色法分析表明，rCKLF1和rCKLF2的转染上清，对Wistar大鼠乳鼠肌卫星细胞具有增殖促进作用。结论 rCKLF1和rCKLF2能够促进骨骼肌细胞的增殖，为进一步探讨CKLF家族分子在骨骼肌细胞增殖分化中的作用提供了实验依据。     

人趋化素样因子2对小鼠成纤维细胞BALB/c 3T3的促增殖和凋亡抑制作用

目的　探讨人趋化素样因子 2 (CKLF2 )对小鼠成纤维细胞BALB c 3T3增殖和凋亡的影响。方法　构建pcDI CKLF2真核表达载体 ;建立稳定表达人CKLF2的BALB c 3T3(3T3 CKLF2 )细胞系 ;以细胞计数和MTT法分析过表达人CKLF2后对 3T3细胞增殖的影响 ;以流式细胞术检测annexin Ⅴ阳性细胞为凋亡指标 ,分析 3T3 CKLF2细胞和 3T3 pcDI细胞对撤除血清诱导凋亡的反应情况。结果　成功地建立了稳定表达人CKLF2的BALB c 3T3细胞系 ,过量表达人CKLF2的 3T3细胞系增殖速度明显加快 ,同等接种量的细胞培养 40h以后 ,3T3 CKLF2细胞的数量 (1.0 7× 10 6 )比 3T3 pcDI细胞(2 .5 4× 10 5)及野生型 3T3细胞 (3 .0× 10 5)高 2～ 3倍 ;流式细胞术分析表明 ,撤除血清后 3T3 CKLF2的annexin Ⅴ阳性细胞数 (13.34% 48h、15 .44 % 96h)明显低于 3T3 pcDI细胞 (19.36 % 48h、39.2 % 96h)。结论　人CKLF2能够促进BALB c 3T3细胞的增殖和抵抗撤除血清诱导的细胞凋亡 ,这些研究为进一步探讨CKLF家族的生物学功能提供了实验依据。     

颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞及基质合成代谢特性的研究

目的 探讨颞下颌关节骨关节病(TMJOA)软骨细胞的细胞生物学特性。方法 通过手术切除部分关节盘的方法,制造TMJOA的兔动物模型;从模型动物处于骨关节病病变增殖修复期的髁突软骨组织中获取细胞体外培养,并采用RT-PCR法比较病变软骨细胞与正常对照细胞对软骨基质蛋白、基质胶原酶和内源性生长因子的表达差异。结果 从TMJOA模型的髁突软骨组织中获得细胞经体外培养、鉴定,确认为软骨细胞;骨关节病髁突软骨细胞对软骨基质蛋白的表达不平衡,对内源性基质胶原酶的表达水平和内源性生长因子TGF-β1、IGF-1的表达明显增强。结论 本研究从细胞生物学角度证实了骨关节病早期关节软骨内出现合成代谢活跃的组织学特点,并发现该阶段组织细胞的修复代偿反应可致软骨基质成分合成的不平衡,最终可导致软骨基质环境改变。