人IL-1β重组表达载体在肝癌细胞的表达及对其NK细胞杀伤敏感性的影响

目的：构建全长人IL-1β真核表达载体,转染H7402肝癌细胞,分析对其NK细胞杀伤敏感性的影响。方法：RT-PCR法扩增人IL-1β基因全长编码序列,经T-A克隆,构建pIRES2-EGFP-IL-1β重组表达载体,采用阳离子聚合物jetPEI的方法转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,RT-PCR分析IL-1β的表达水平,MTT方法分析转染前后NK细胞对肝癌细胞杀伤活性的变化。结果：从LPS处理的人外周PBMCs总RNA中扩增出IL-1β（大小约829 bp）,先构建pMD18-IL-1β克隆载体,DNA序列鉴定正确后,利用Pfu DNA聚合酶将IL-1β基因亚克隆到pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-IL-1β,经PCR、限制性酶谱分析（BamHⅠ和EcoRⅠ）和DNA序列测定正确后,将其转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达IL-1β的细胞,与转染空载体的细胞相比,该细胞对NK-92细胞杀伤的敏感性显著降低,效靶比10∶1时下降了约30%。结论：促炎性细胞因子IL-1β能够显著增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是导致肝癌细胞发生天然免疫逃逸的重要机制。     

小鼠IL-35基因的克隆及原核表达

目的 克隆小鼠mIL-35两亚基mEBI3,mIL-12p35 cDNA,并构建mIL-35基因的原核表达载体并进行诱导表达.方法 RT-PCR方法从RAW246.7细胞中扩增mEBI3基因及脂多糖体外刺激BALB/c小鼠的脾细胞中扩增mIL-12p35基因,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35基因,并构建原核表达载体pET-30a-mIL-35,转化感受态E.coli BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测目的蛋白的表达.结果 成功克隆了mEBI3、mIL-12p35 cDNA,通过重叠PCR方法扩增出mEBI3-Linker-mIL-12p35片段,并构建出原核表达载体pET-30a-mIL-35;在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为50 000的重组mIL-35蛋白,目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中.结论 利用构建的原核表达载体pET-30a-mIL-35成功表达出mIL-35蛋白,为进一步探讨mIL-35的生物学功能奠定了基础.     

人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)原核表达及初步应用

目的:克隆人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)基因并构建原核表达载体,用纯化的重组蛋白进行系统性硬化症(SSc)体外诊断应用研究.方法:从体外培养的HeLa细胞中提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hnRNP I基因,构建原核表达载体pET-30a-hnRNP I,在原核表达系统E.coli BL21(DE3)中表达重组蛋白.重组蛋白纯化后作为抗原对包括系统性硬化症(SSc)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、混合型结缔组织病(MCTD)、未分化型结缔组织病(UCTD)、类风湿性关节炎(RA)、正常对照(control)在内的血清相应抗体进行ELISA检测.结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-hnRNP I,在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(M_r)为59 600的重组hnRNP I蛋白,重组蛋白可以可溶蛋白和包涵体蛋白两种形式存在.hnRNP I蛋白抗体在SSc中阳性率(48.72%)明显高于其他各组(P<0.05).结论:利用构建的原核表达载体成功表达出hnRNP I蛋白,此重组蛋白可用于SSc的临床诊断检测. UCTD) 类风湿性关节炎(RA)、正常对照(control)在内的血清相应抗体进行ELISA检测.结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-hnRNP I,在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为59 600的重组hnRNP I蛋白,重组蛋白可以可溶蛋白和包涵体蛋白两种形式存在.hnRNP I蛋白抗体在SSc中阳性率(48.72%)明显高于其他各组(P<0.05).结论:利用构建的原核表达载体成功表达出hnRNP I蛋白,此重组蛋白可用于SSc的临床诊断检测. UCTD) 类风湿性关节炎(RA)、正常对照(control)     

mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体的构建及鉴定

目的构建mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体。方法从ConA活化的BALB／c小鼠脾细胞中抽提总RNA,RT—PCR方法扩增小鼠IL-21基因,XhoⅠ和HindⅢ双酶切后克隆入真核细胞高效表达载体pcDNA3．1中,构建小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1,并经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析对重组子的正确性进行鉴定。结果构建的小鼠IL-21真核表达载体mIL-21／PcDNA3．1经PCR、限制性酶谱分析和DNA序列分析证明获得了目的基因,其序列与Genbank中登录的小鼠IL-21基因序列完全一致。结论成功构建了。mIL-21／PcDNA3．1真核表达载体,为IL-21分子的进一步研究奠定了基础。     

IL-12基因转染的人树突状细胞加强细胞免疫反应的体外研究

目的:探讨IL-12基因转染的树突状细胞(DCs)能否体外加强细胞免疫反应.方法:脂质体转染(经过Flt-3L、SCF、GM-CSF刺激)增殖周期中的DCs前体细胞.加入GM-CSF、IL-4和TNF-α扩增转染细胞.在流式细胞仪上分析细胞表型及IL-12的表达.成熟DCs装载上分别能与HLA-I 类和HLA-II类分子结合的多肽,观察IL-12基因转染DCs对特异性Th细胞发育及特异性CTL诱导和功能的影响.结果:IL-12基因转染细胞在上述细胞因子作用下发育成为能有效表达IL-12并具有典型形态学与表型特征的DCs.在装载上CD4+T细胞表位HBcAg50-69后,能诱导这些细胞发育成为IFN-γ产生型的Th1细胞.HLA-A201亚型DCs在其同时装载CD4+T和CD8+T细胞相应的表位后,IL-12 基因转染DCs所诱导产生的自身淋巴细胞的CTL效应增强.结论:IL-12基因转染的DCs能增强对Th1细胞的刺激和CTL效应的诱导能力,提示它在肿瘤疫苗发展中的潜力.     

C-erbB-2癌基因蛋白与类固酵激素受体联合检测在乳腺癌预后中的意义

探讨Ｃ－ｅｒｂＢ－２癌基因蛋白与类固醉激素受体联合检测在乳腺癌预后判断中的价值及两者的关系。方法用免疫组化技术对５７例乳腺良恶性肿瘤进行了Ｃ－ｅｒｂＢ－２癌基因蛋白、类固醇激素受体（ＥＲ、ＰＲ、ＡＲ）６５检测。结果５０例乳腺癌中２１例（４２％）Ｃ－ｅｒｂＢ－２过度表达，均为浸润性导管癌。７例良性病变均为阴性，ＥＲ，ＰＲ，ＡＲ阳性率分别为７２％，６２％，６６％。良性病变中２例ＥＲ，１例ＰＲ为弱阳性，余者为阴性，结论Ｃ－ｅｒｂＢ－２的表达与ＥＲ，ＰＲ，ＡＲ呈负相关关系〔Ｐ＜０．０５），在肿瘤细胞核级中，Ｃ－ｅｒｂＢ－２的表达与ＥＲ，ＰＲ崳粒乙渤矢合喙毓叵担ǎ颍剑埃梗常福常埃梗福担叮埃梗梗福担校迹埃埃担茫澹颍猓拢补缺泶镎吡馨徒嶙坡矢撸ǎ校迹眨眨保     

过敏性腹泻小鼠大肠黏膜中T细胞亚群的表达与Th1/Th2型细胞因子的关系

目的 检测小鼠过敏性腹泻模型大肠黏膜中T细胞亚群的表达和血清中Th1型细胞因子(IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-4)和OVA-IgE水平,探讨腹泻小鼠大肠黏膜中T细胞亚群的表达特点与Th1/Th2型细胞因子的关系.方法 雌性BALB/c小鼠20只随机分成两组,即对照组和实验组.采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IFN-γ,IL-4及OVA-IgE的水平,取大肠组织HE染色观察大肠组织病理改变,免疫组织化学染色观察T细胞亚群的表达情况.结果 与对照组相比,实验组小鼠非特异性炎症反应明显,上皮不规则排列,腺区存在大量白细胞(WBC)浸润,固有层可见大量嗜酸性粒细胞(EOS)浸润.CD3,CD4,CD8免疫组织化学染色显示,与对照组相比,肠黏膜固有层可见大量CD3+,CD4+,CD8+细胞.实验组IL-4,OVA-IgE分泌水平明显升高,IFN-γ分泌水平和IFN-γ/IL-4比值显著降低(P<0.01).嗜酸粒细胞百分比与CD4+/CD8+比值呈显著正相关(P<0.05).结论 过敏性腹泻小鼠大肠黏膜局部CD4+T细胞亚群明显增加,CD4/CD8细胞比例失衡,并与Th1/Th2型细胞因子向Th2型漂移及EOS浸润程度相关.     

IL-10与疾病关系的研究进展

IL-10是一种重要的抗炎细胞因子,对多种免疫细胞功能均有抑制作用.这种细胞因子的特殊生理意义在于防止和抑制强大的特异和非特异性免疫反应和由此导致的组织损伤,同时IL-10可增强“清道夫”功能,并有助于诱导免疫耐受.IL-10的这些作用与疾病的发生有密切的联系,因此研究其分子机制和生物学特征对IL-10相关性疾病的免疫...     

乳腺癌c-erbB-2、nm23基因扩增及产物表达

目的：探讨乳腺癌癌基因和抑癌基因表达与预后的关系。方法：应用组织原位杂交及免疫组化技术对２５例新鲜乳腺癌标本的ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｎｍ２３基因扩增及产物表达进行了检测。结果：ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｍＲＮＡ杂交信号主要位于癌细胞胞浆中，杂交颗粒的多少不均，阳性细胞呈异质性分布，ｃ－ｅｒｂＢ－２蛋白在该组表达率为４０％（１０／２５），ｃ－ｅｒｂＢ－２蛋白阳性颗粒分布于癌细胞膜上，随着肿瘤恶性程度的增加，ｃ－ｅｒｂＢ－２基因扩增及蛋白表达都增加（Ｐ＜０．０５）。ｎｍ２３基因扩增及产物表达却随肿瘤恶性程度的增加而减少（Ｐ＜０．０５），ｎｍ２３ｍＲＮＡ杂交颗粒位于胞浆中，蛋白的表达可见于胞浆中，少数见核中阳性，该组ｎｍ２３蛋白表达率为４４％（１１／２５）。结论：ｃ－ｅｒｂＢ－２、ｎｍ２３基因扩增及产物表达呈负相关关系（Ｐ＜０．０５），且与乳腺癌临床病理特征密切相关     

胸腺基质淋巴细胞生成素在过敏性腹泻小鼠大肠黏膜的表达

目的:探讨过敏性腹泻小鼠大肠黏膜中胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的表达及分布。方法:5~6周龄BALB/c雌性小鼠经卵白蛋白(OVA)隔1周2次致敏,实验组小鼠第2次致敏1周后每隔1 d给予溶解于350μL无菌PBS的OVA灌胃,而对照组则不予致敏,仅在致敏后接受与实验组相同的干预,于第10次灌胃后2 h内处死,取血离心收集血清做ELISA检测IL-4、IFN-γ及OVA-IgE水平,取肠系膜淋巴结分离细胞培养72 h离心收集上清测IL-4及IFN-γ的水平,取肠组织行HE染色观察肠组织病理改变,行免疫组织化学染色观察TSLP的分布,实时定量RT-PCR检测TSLP mRNA的表达情况。结果:与对照组相比,实验组小鼠结肠黏膜充血水肿,腺区有大量炎性细胞浸润,固有层可见大量嗜酸性粒细胞。TSLP染色强度显著增强,在上皮呈连续性表达,并在腺区大量分布。TSLP mRNA平均表达水平较对照组显著提高(P<0.01)。TSLP mRNA表达水平与肠系膜淋巴结分离细胞的培养上清中IL-4表达水平呈显著正相关(r=0.904,P<0.01);而与IFN-γ水平呈显著负相关(r=-0.886,P<0.01);同时实验组小鼠血清中可见高水平OVA-IgE的表达。结论:TSLP在正常肠黏膜存有生理性表达,而在过敏性腹泻小鼠结肠近端黏膜表达量显著增加,TSLP的过度表达可能是促进过敏性腹泻发生发展的重要环节。