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目的 :应用四环素 (tetracycline,Tet)可调控系统建立可调控的抗恶性疟原虫的DNA疫苗。方法 :首先构建恶性疟原虫顶端膜抗原 1(AMA 1)基因和转录激活因子 (tTA或rtTA)基因的真核表达质粒pTL 8/AMA 1和pTL 8/AMA 1(rtTA) ,并大量制备这两种质粒及表达转录抑制子 (tTS)的质粒pUHS6 1。以pTL 8/AMA 1、pTL 8/AMA 1(rtTA)和pTL 8/AMA 1(rtTA)加pUHS6 1/tTS免疫小鼠后 ,用四环素类似物强力霉素 (doxcycline ,dox)诱导或抑制上述DNA载体内AMA 1的表达 ,并分离小鼠血清检测针对AMA 1抗体的表达情况。结果 :①构建了真核表达质粒pTL 8/AMA 1和pTL 8/AMA 1(rtTA) ;②pTL 8/AMA 1和pTL 8/AMA 1(rtTA)在没有被诱导表达时 (仅基础表达 ) ,可诱导明显的免疫应答。在以pTL 8/AMA 1(rtTA)与含tTS的pUHS6 1共同免疫后 ,可极大地降低其免疫应答。应用dox诱导pTL 8/AMA 1(rtTA)中的AMA 1基因表达后 ,可明显引起免疫应答。结论 :pTL 8/AMA 1(rtTA)附加pUHS6 1构成了可调节的DNA免疫系统。该系统的建立将对进一步深入研究DNA疫苗的免疫机制和调控基因表达 ,减少不良免疫反应以及进行可精确调控的基因治疗打下一定的基础 相似文献
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1 材料和方法1.1 材料 QIAGEN Plasmid Maxi kit (QIAGEN- tip 5 0 0 ) ,纯化专用试剂 (P1,P2 ,P3,QBT,QC,QF,具体配方见 QI-AGEN质粒纯化手册 ) . pc DNA3.1(- ) /MSP1 - 1 9为将 PCR扩增的恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1(MSP1)的 17区基因片段(30 0 bp)以 Eco RI和 Bam HI酶切位点克隆入 pc DNA3.1(- )中 [2 ] ,pc DNA3.1(- )为 Introgen公司的真核表达质粒 .在研究 pc DNA3.1(- ) /MSP1 - 1 9作为 DNA疫苗效果时 ,需大量纯化该质粒 ,故本研究在纯化该质粒的同时 ,同样用该质粒进行纯化柱再生研究 .菌株为大肠… 相似文献
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目的 探讨细胞因子表达质粒对小鼠DNA免疫的促进和调节作用。 方法 构建编码恶性疟原虫顶端膜抗原1(AMA1)完整胞外域的DNA免疫质粒VR1020/E,构建编码小鼠细胞因子(GMCSF)、白细胞介素(IL)如IL4和IL12的真核表达质粒pcDNA3/GMCSF、pcDNA3.1( ) /IL4和pIL12以及双顺反子质粒pGM CSF/pTPA E,分组免疫小鼠,ELISA检测血清中特异性IgG及其亚类的水平,取小鼠脾细胞进行体外增殖。 结果 3种细胞因子质粒均有效增强了小鼠针对VR10 20/E的免疫应答,抗体水平增加7至10倍,其中pcDNA3/GMCSF质粒和pIL12质粒分别显著促进了小鼠的IgG1和IgG2a应答,小鼠脾细胞的体外增殖水平亦有明显提高。 结论 利用编码GM CSF、IL4和IL12的表达质粒作为佐剂可有效增强小鼠针对AMA1DNA的免疫应答,并对免疫应答的类型产生调节作用。 相似文献
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雷俊川 《国际医学寄生虫病杂志》2002,(6)
动物利什曼病在临床上和免疫学方面的表现多样,而且很多属于隐性感染,因而诊断比较困难。用于诊断利什曼病的传统方法有病原学检查(淋巴结、骨髓穿刺物镜检、培养或动物接种),免疫学检查(ELISA、Western印迹分析)和淋巴液、骨髓液的PCR。但是 相似文献
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目的 克隆adr亚型乙型肝炎病毒核心启动子(core promoter,Cp)并鉴定其在肝细胞系的特异性表达.方法 利用PCR从质粒pUC19/3HBV扩增adr亚型乙肝病毒核心启动子,并将其克隆入T载体pMD19-T Simple中.测序正确后再亚克隆入pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体.将重组载体pGL3-Basic/Cp分别转染肝癌细胞系HepG2、宫颈癌细胞系Hela、绿猴肾细胞系COS-7、乳腺癌细胞系MDA-MB-231和结肠癌细胞系HT-29,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶在这些不同细胞系中的活性,以确定所克隆的基本核心启动子是否具有肝细胞特异性活性.结果 从HBV基因组中成功克隆了Cp,Cp在肝细胞系中具有明显的活性,而在其他组织来源的细胞系中几乎没有活性.结论 克隆得到的核心启动子具有明显的肝细胞特异性活性. 相似文献
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目的 构建四环素操纵子 (TetO)修饰的恶性疟原虫血型糖蛋白结合蛋白 13 0基因 (GBP13 0 )启动子 ,并探讨TetO插入后对启动子活性影响的位置效应。 方法 将 7个拷贝的TetO ( 7cot)序列分别克隆入GBP13 0启动子转录起始点附近的 4个位点 ,上、下游各两个 ,产生 4个衍生质粒pG/ 7T( -5 ) ,pG/ 7T( -2 ) ,pG/ 7T( +2 )和pG/ 7T( +5 )。瞬时转染后通过CATELISA检测和分析pGBPCATΔ2和 4个衍生质粒中CAT报告基因的表达水平。 结果 限制性酶切、PCR扩增和DNA测序证明质粒构建成功。转染和CAT检测表明 ,7cot插入到GBP13 0启动子的 4个位点中均可提高启动子的活性 ,并且定位于启动子下游比定位于上游具有更高的活性 ,其中于 +5位点启动子活性最高。 结论 在疟原虫四环素诱导性转基因表达系统中质粒pG/ 7T( +5 )可作为反应质粒加以应用。 相似文献
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目的 建立可表达随机12肽库的逆转录病毒初级文库的构建方法 并优化其实验参数.方法 体外合成可编码随机12肽的DNA片段.将该DNA片段克隆入带有EGFP标记的逆转录病毒载体pQCX-IX-EGFP,连接产物电击转化大肠杆菌,转化所得菌液即为可表达随机12肽库的逆转录病毒初级文库,其间通过大量的实验优化:插入片段与载体的摩尔比、连接反应的条件、连接产物的DNA浓度以及电击转化参数等关键的实验参数.结果 按照本研究所确立的方法 和最佳实验参数构建的可表达随机12肽库的逆转录病毒初级文库的滴度为2.85×105cfu/mL,成功转化子的比例接近100%,编码随机12肽的DNA序列正确率为83%.结论 成功建立了可表达随机12肤库的逆转录病毒初级文库的构建方法 ,并确定了最佳的实验参数,为后续的可表达随机12肽库的逆转录病毒表达系统的建立奠定了良好的基础. 相似文献
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