用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。     

Binl—b蛋白及其mRNA在少弱精子症模型大鼠附睾中的表达

目的:验证Binl—b蛋白及其mRNA在少弱精子症模型大鼠附睾中的表达,探讨Binl—b在病理状态下附睾中表达的改变。方法:取雄性大鼠30只,随机分为两组,模型组给予雷公藤(10mg/ kg/d)灌胃,连用8W成少弱精子症模型;对照组给予1%羧甲基纤维钠混悬液灌胃。采用免疫组化S—P法和原位杂交方法检测Binl—b蛋白和Binl—bmRNA在两组大鼠附睾组织中的表达情况。结果:Binl—b蛋白表达于对照组、模型组大鼠的附睾管腔上皮、主细胞、基细胞,但在模型组中表达明显增强(P<0.01)。Binl—bmRNA表达于模型组、对照组附睾管腔上皮、主细胞、基细胞,但其在模型组中的表达明显增强(P<0.01)。结论:Binl—b蛋白及其mRNA在少弱精子症大鼠附睾内表达较正常大鼠明显增强,提示Binl—b可能是病理状态下雄性大鼠生殖系统的内源性防御分子之一。     

弱精子症动物模型中尿纤溶酶原激活因子的含量及表达情况研究

目的:利用奥硝唑所致弱精子症动物模型,采用免疫组化方法和RT-PCR技术,了解尿纤溶酶原激活因子(uPA)在弱精子症动物模型中的含量及表达情况,初步探讨奥硝唑所致弱精子症动物模型的机制及uPA作为预防或治疗弱精子症药物的可能性。方法:48只雄性SD大鼠随机分为1d用药组,5d用药组,10d用药组,15d用药组,20d用药组和对照组,每组8只,用药组每天给予奥硝唑200mg/kg,对照组给予0.5%羧甲基维素钠连续灌胃,用药组分别在给药第1、5、10、15、20d后24h内,麻醉处死动物取附睾和睾丸。低渗肿胀试验检测精子细胞膜完整性,免疫组化方法动态观察睾丸与附睾组织中uPA蛋白表达情况,RT-PCR检测睾丸组织中uPAmRNA含量。结果:奥硝唑持续给药构建弱精子症时,精子膜完整性下降发生在给药的第10d,并一直维持低值。与建立弱精子症模型同步的uPA在睾丸和附睾组织蛋白表达及mRNA含量下降在用药15d,下降趋势上是平行的,而显效性稍滞后。用药15d组与用药20d组uPA蛋白表达、mRNA水平分别与对照组比较有统计学意义(P<0.05)。结论:精子细胞膜受损、运动能力下降与uPA表达及含量下降平行,奥硝唑所致弱精子症模型形成可能是由于uPA含量及表达下降所致。弱精子症形成原因较复杂,uPA含量及表达的下降可认为是弱精子症形成因素之一,检测uPA含量可能有助于弱精子症的诊断和预防。     

Endothelial nitric oxide synthase traffic inducer in the umbilical vessels of the patients with pre-eclampsia

The expression of endothelial nitric oxide synthase traffic inducer （NOSTRIN） was examined in the umbilical vessels of the patients with pre-eclampsia （PE） to explore its possible role in the pathogenesis of PE. The NOSTR1N rnRNA in umbilical tissues was determined by RT-PCR. The eNOS activity in umbilical vessels was spectrophotometrically detected. NO2 /NO3, the stable metabolic end products of NO, was measured by using nitrate reductase. RT-PCR showed that the expression level of NOSTRIN was significantly higher in women with PE than in the normal group （P〈0.01）. The activity of eNOS was significantly decreased in PE group [（12.83±3.61） U/mg] than in normal group [（21.72±3.83） U/mg] （P〈0.01）. The level of NO2-/NO3- in PE patients （27.53±7.48） pmol/mg was significantly lower than that of normal group （54.27±9.53） μmol/mg （P〈0.01）. The significant negative correlation existed between the expression of NOSTRIN and the activity of eNOS in umbilical vessels of women with PE （r=-0.58, P〈0.01）. It was concluded that the level of NOSTR1N expression was increased in umbilical vessel of women with PE, indicating that it may be involved in the pathogenesis of PE.     

异丙苯过氧化氢体内致大鼠睾丸和附睾过氧化的初步研究

目的:建立异丙苯过氧化氢(cHP)体内过氧化模型,探讨cHP体内过氧化对大鼠睾丸组织和附睾精子的影响,及对精子核DNA断裂的影响。方法:90日龄雄性W istar大鼠52只,设cHP 1/10 LD50、1/6 LD50、1/4 LD503个剂量组和对照组,cHP 1/10 LD50、1/6 LD50组和对照组每组大鼠12只,1/4 LD50组大鼠16只。用无菌生理盐水稀释70%cHP水剂配制,按2 m l/kg经腹腔每日1次注射,对照组给同体积生理盐水,观察一般中毒症状和体征。连续1周,最后1次给药24 h后处死动物。分光光度法测定睾丸组织匀浆、附睾头部和尾部精子丙二醛含量,用单细胞凝胶电泳检测睾丸生精上皮细胞、附睾头部和尾部精子核DNA断裂发生率,计数附睾尾部精子活动率,睾丸和附睾常规石蜡切片,苏木精-伊红染色观察病理变化。结果:给予cHP大鼠活动稍差,无死亡,1/6 LD50、1/4 LD50 cHP组体重降低明显(P<0.001)。1/6 LD50、1/4 LD50 cHP组大鼠睾丸和附睾精子丙二醛浓度均明显高于对照组,附睾尾部精子活动率均明显降低,睾丸生精上皮细胞和附睾头部精子核DNA断裂发生率明显高于对照组,附睾尾部精子核DNA断裂的发生率与对照组差异无显著性(P>0.05)。1/10 LD50 cHP组大鼠体重变化、睾丸丙二醛浓度、附睾尾部精子活动率、睾丸生精上皮细胞和附睾精子核DNA断裂与对照组比较,差异均无显著性(P>0.05)。结论:1/6 LD50、1/4 LD50 cHP能在体内使大鼠睾丸和附睾精子发生过氧化,并使细胞核DNA发生断裂,核DNA断裂的主要部位可能在睾丸组织,对附睾尾部精子核DNA断裂无明显影响。     

鼠巨细胞病毒感染对雄性小鼠生殖性激素水平的影响

目的研究鼠巨细胞病毒（MCMV）感染后雄性小鼠生殖性激素水平的变化，探讨MCMV感染影响雄性生殖功能的可能机制。方法选择无McMV活动感染的雄性小鼠，睾丸接种MCMV或不合MCMV的细胞培养液，设立实验组与对照组，采用放射免疫法检测接种后不同时段（小鼠一个生精周期内）的小鼠血清及睾丸组织内性激素含量，并进行比较。结果睾丸匀浆组织T浓度在MCMV感染第4～9d显著降低（P〈0．05），第14～21d有一短暂恢复过程，第38d又较对照组下降（P〈0.05）。血清LH浓度在MCMV感染的第4、9、14d显著升高（P〈0．05），其它时间点比较差异无统计学意义（P〉0．05）。而感染不同时期的血清T和FSH比较差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论MCMV急性感染可引起雄鼠生殖内分泌激素水平的改变：通过影响其下丘脑-垂体-性腺轴的调节导致雄鼠生殖功能障碍。     

野山楂根拮抗雷公藤多苷对雄性大鼠生炙鹕俗饔玫难芯

目的观察中药野山楂根水煎剂对雷公藤多苷所致雄性不育大鼠生育力的影响.方法将成年雄性大鼠随机分组,分别给予雷公藤多苷片溶液(10 mg·kg-1),野山楂根水煎剂(1.8,5.4,18 g·kg-1)+雷公藤多苷片溶液(10 mg·kg-1)和蒸馏水(1 mL·kg-1)灌胃,8周后停用雷公藤多苷,中药组继续行野山楂根灌胃.4周后各组动物与成年雌性大鼠交配,观察交配雌鼠妊娠率和平均胚胎、黄体数.测定雄鼠生殖器官性腺脏器指数、附睾精子计数、活力、存活率,观察各组动物睾丸、附睾组织病理和超微结构改变,放射免疫法测定血清和睾丸组织睾酮(T),血清卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)含量.结果与雷公藤多苷模型组比较,野山楂根组交配雌鼠妊娠胎数、雄鼠睾丸、附睾脏器指数以及附睾精子计数、活力均有提高(P＜0.05);野山楂根组精子超微结构较模型组有明显恢复;睾丸组织匀浆T显著高于模型组(P＜0.01).结论野山楂根能够拮抗雷公藤多苷对雄性大鼠的生殖损伤作用,提高不育症模型雄鼠的生育力.     

巨细胞病毒感染后雄鼠生殖细胞凋亡与睾丸NF-κBp65的表达

目前,大多学者认为人巨细胞病毒(HCMV)是引起男性不育的病原微生物之一.本文建立睾丸鼠巨细胞病毒(MCMV)感染模型,采用Hoechst 33258染色法对MCMV感染不同时期睾丸组织进行生殖细胞凋亡检测,同时采用免疫组化染色(S-P法)检测MCMV感染不同时期睾丸组织生殖细胞内核因子-κB亚基p65亲和肽(NF-κBp65)的表达情况,探讨MCMV感染对雄鼠生殖细胞凋亡的影响,研究睾丸组织NF-κBp65表达与生殖细胞凋亡的相关性,揭示NF-κBp65对生殖细胞凋亡的调控机制及NF-κBp65在MCMV致病机制及机体抵御MCMV感染中的可能作用.     

NOSTRIN在无精子症患者睾丸组织中的表达

目的:通过测定无精子症患者睾丸组织中内皮型一氧化氮合酶运输介导物(NOSTRIN)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达,探讨其与无精子症发病的相关性。方法:采用免疫组化法检测17例特发性无精子症患者(病例组)和10例正常男性(正常组)睾丸组织中NOSTRIN的定位和定量表达;RT-PCR检测睾丸组织中NOSTRINmRNA的表达;分光光度法测定睾丸组织中eNOS的活性;应用硝酸还原酶法测定睾丸组织上清液中NO代谢产物亚硝酸基/亚硝基(NO2-/NO3-)水平。结果:NOSTRIN在睾丸组织中表达于生精细胞、支持细胞以及血管内皮细胞,NOSTRIN在特发性无精子症患者睾丸中的表达水平显著低于正常男性;病例组患者睾丸组织中NOSTRINmRNA呈弱表达(0.312±0.076),明显低于正常组(0.793±0.082,P<0.01);病例组患者睾丸组织eNOS活性[(33.727±3.58)U/mg]与正常组[(17.69±3.84)U/mg]比较显著增高(P<0.01);病例组患者睾丸中NO2-/NO3-水平为[(48.56±8.49)μmol/L],与正常组[(25.37±9.61)μmol/L]比较显著升高(P<0.01);病例组睾丸组织中NOSTRIN表达水平与eNOS活性呈负相关(r=-0.57,P<0.01),与NO代谢产物NO2-/NO3-同样呈负相关(r=-0.61,P<0.01)。结论:无精子症患者睾丸组织中NOSTRIN表达水平降低,eNOS活性增强,NO-/NO-水平升高,这可能与无精子症的发生有着相关性。     

HSP70在小鼠睾丸巨细胞病毒感染中的表达及作用

 目的 研究鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)感染的不同时期细胞因子热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)在小鼠睾丸组织中的表达,探讨HSP70在MCMV致病机制及机体抵御MCMV感染中的可能作用.方法 建立小鼠睾丸MCMV急性感染模型,采用免疫组织化学SP法检测不同感染时段的睾丸组织内HSP70的表达与定位,分析其表达情况与病毒增殖及睾丸病变程度的相关性.结果 接种病毒后不同时期的睾丸组织中HSP70表达程度不同,MCMV感染第1天起其表达开始增加(P＜0.01),感染的第6～9天增至高峰(P＜0.01),此时MCMV增殖程度最重,睾丸组织发生最为严重的病理性炎性改变.随感染时间延长,HSP70表达水平下降,病毒增殖减少,睾丸组织病损程度减轻.结论 MCMV感染时,HSP70在睾丸组织中的表达与MCMV增殖及睾丸组织病变程度相关,提示HSP70可能参与MCMV感染的致病机制及机体抵御MCMV感染机制.