TRIM33对人脑胶质瘤U251细胞生物学功能影响的实验研究

目的观察低氧条件下TRIM33基因表达的变化情况及对胶质瘤U251细胞生物学功能的影响。方法将U251细胞分别在低氧及常氧条件下培养不同时间,采用实时荧光定量PCR及Western blot检测TRIM33的表达变化情况。通过构建TRIM33过表达慢病毒转染U251细胞,采用Western blot检测转染后U251细胞TRIM33的表达,低氧条件下利用CCK-8检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移及侵袭,Western blot检测上皮－间质转化（EMT）相关蛋白的表达情况。结果（1）与常氧条件培养的U251细胞相比,低氧条件下U251细胞中的TRIM33表达发生下调（P〈0.001）。（2）与空白对照组相比,TRIM33组的TRIM33相对表达水平明显升高（P〈0.001）。（3）CCK-8实验表明,与空白对照组相比,TRIM33组的细胞增殖活力差异无统计学意义（P〉0.05）。（4）Transwell实验结果显示,TRIM33组的迁移及侵袭能力较空白对照组明显降低（均P〈0.05）。（5）Western blot结果显示,与空白对照组相比,EMT相关蛋白即波形蛋白、N-钙黏素表达水平均明显降低（均P〈0.01）,E-钙黏素表达水平显著升高（P〈0.001）。结论在低氧条件下人脑胶质瘤U251细胞TRIM33表达发生下调,过表达TRIM33可以显著抑制低氧环境对U251细胞迁移、侵袭的影响,其可能是通过影响EMT实现的。TRIM33可作为拮抗低氧微环境的潜在基因治疗靶点。     

EA-IL-15溶瘤腺病毒的构建及其对胶质瘤细胞特异性及有效性研究

目的 构建插入EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒(oAD-EA-IL-15),探讨其在体外对胶质瘤细胞的杀伤效果和特异性。方法 PCR法将EA-IL-15双基因插入腺病毒穿梭载体pXC1,将穿梭质粒pXC1-EA-IL-15及辅助质粒pBHG loxΔE1,3 Cre质粒共转染HEK393细胞,获得溶瘤腺病毒oAD-EA-IL-15。通过CCK-8细胞毒性实验,测定细胞相对活性,绘制剂量反应曲线。结果 成功构建溶瘤腺病毒载体(oAD)及含EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒载体(oAD-EA-IL-15);体外包装获得相应的溶瘤腺病毒oAD和oAD-EA-IL-15;oAD对小鼠胶质瘤细胞GL261有明显杀伤作用(P＜0.05),对小胶质细胞BV2(非肿瘤细胞)的杀伤作用明显低于对GL261(P＜0.05),说明oAD具有特异性;oAD-EA-IL-15和oAD分别感染GL261、BV2细胞,对于GL261,oAD-EA-IL-15的半抑制浓度(IC₅₀)值为0.58×10⁷±1.30×10⁵ PFU/ml较oAD的IC₅₀值1.13×10⁷±1.98×10⁵PFU/ml低,对肿瘤细胞的杀伤作用强于oAD(P＜0.01),对于BV2,oAD-EA-IL-15对其活性的影响低于oAD(P＜0.01),说明oAD-EA-IL-15病毒的特异性优于oAD病毒。结论 携带EA-IL-15双基因的溶瘤腺病毒在体外对胶质瘤细胞具有明显的杀伤作用和特异性,可为胶质瘤治疗提供更加特异有效的途径。     

TGFβ／Smads通路中信号转导蛋白Smad2与Smad3的差异性研究进展

转化生长因子β（transforminggrowthfactor-β,TGFβ）分布于多种组织细胞中,在调节细胞增殖、分化、代谢和迁移等功能中均有重要作用。研究显示许多恶性脑胶质瘤分泌大量的TGFβ,且与肿瘤的恶性程度呈正相关,即恶性程度越高,肿瘤分泌的TGF β越多。     

TGF-βRI与Fascin1的相互作用

目的探讨TGF-βRI和Fascin1的相互作用。方法用免疫荧光证实TGF-βRI和Fascin1的共定位。用GST pull-down和Co-IP的方法验证TGF-βRI和Fascin1的相互作用及其相互作用的位点。结果 TGF-βRI和Fascin1能共定位。Fascin1与TGF-βRI相互作用,相互作用位点是Fascin1的氨基端和TGF-βRI的膜内区。结论 TGF-βRI与Fascin1存在相互作用,相互作用位点是Fascin1的氨基端和TGF-βRI膜内区。     

细胞融合通过PI3K-AKT通路降低黑色素瘤细胞增殖能力

目的研究细胞融合在黑色素瘤细胞增殖中的作用及其分子机制。方法用聚乙二醇细胞融合方法融合黑色素瘤细胞,通过流式分选获得稳定的融合细胞。体外培养及细胞计数检测融合细胞的增殖速度。Affymatrix基因芯片分析差异表达的基因,IPA软件进行基因功能分析。Western blot检测细胞蛋白。结果 PEG化学融合法成功获得稳定的黑色素瘤融合细胞,其体外增殖速度明显减慢(P<0.01)。黑色素瘤融合细胞与增殖相关的PI3K-AKT通路明显下调(P<0.01)。融合细胞phospho-S6蛋白表达明显降低。结论细胞融合通过PI3K-AKT通路降低黑色素瘤细胞增殖能力。     

人脑胶质瘤干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究

目的 探讨体内外原代培养的人脑胶质瘤干细胞(GSCs)与胶质瘤新生血管内皮细胞的关系.方法 新鲜高级别(WHOⅢ级、Ⅳ级)的人脑胶质瘤标本经原代培养获取GSCs,免疫组化法检测其肿瘤干细胞及干细胞标记物Nestin的表达;鉴定后的GSCs经低氧诱导,免疫荧光法检测其诱导分化后内皮细胞标记物CD31、CD144和胶质瘤细胞标记物GFAP的表达,RT-PCR和Western-blot法检测其CD31的表达;建立胶质瘤干细胞皮下荷瘤裸鼠模型,免疫组化技术检测模型中人来源的CD31的表达.结果 (1)悬浮生长的胶质瘤干细胞球样细胞经免疫组化鉴定Nestin表达阳性;(2)低氧诱导后的GSCs能够表达CD31、CD144,有些细胞能够同时表达CD144和GFAP;(3)RT-PCR检测发现GSCs在诱导前后都有CD31 mRNA的表达,而Western-blot检测到只有诱导后的GSCs有CD31蛋白的表达;(4)胶质瘤干细胞荷瘤裸鼠模型的肿瘤组织中部分微血管抗人CD31抗体染色阳性.结论 胶质瘤干细胞不仅在体外低氧条件下可分化为内皮细胞,在体内微环境条件下同样可分化为血管内皮细胞,并参与胶质瘤新生组织的血液供应.     

雷帕霉素在免疫抑制和肿瘤抑制中的双重作用

雷帕霉素（rapamycin）是近年来应用较多的免疫抑制剂，它在肿瘤治疗中也发挥重要作用。雷帕霉素（rapamycin）与FKBP12结合，形成Rapamycin- FKBP12复合物，这一复合物抑制mTOR (mammalian target of rapamycin)的活性，进一步抑制mTOR下游的一系列分子的合成或功能。雷帕霉素可将免疫细胞滞留于G1期，阻止免疫细胞的增殖；抑制IL-2和其他的免疫分子的合成,从而发挥其免疫抑制作用。另一方面，对于肿瘤细胞，雷帕霉素抑制其生长和增殖，发挥肿瘤抑制作用。它的这一双重功能可应用在器官移植和肿瘤治疗的交叉领域。     

人胶质瘤自杀基因细胞系的建立及其在胶质瘤治疗研究中的应用

目的 构建CD基因工程化人脑胶质瘤细胞并在此基础上进行胶质瘤治疗研究。方法 通过In-fusion基因克隆的方法,构建携带CD基因慢病毒载体;通过293T细胞体外包装获得慢病毒,并测定病毒效价;通过慢病毒体外感染细胞获得CD基因工程化人脑胶质瘤细胞;通过流式分选获得基因稳定表达细胞;通过CCK-8评价加入5-FC前药和(或)HSV-1后细胞存活率。结果 成功构建pLVX-CD-IRES-ZsGreen1慢病毒载体并体外包装获得相应慢病毒;慢病毒感染人脑胶质瘤U87细胞后获得携带CD基因的阳性细胞,并通过体外培养30天后流式分选获得稳定阳性细胞;加入前药5-FC和(或)HSV-1后对携带CD基因的U87细胞杀伤作用明显(P<0.01),其中5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞作用更加高效(P<0.01)。结论 成功获得携带CD基因的人脑胶质瘤细胞;前药5-FC联合HSV-1对胶质瘤细胞具有更加高效的杀伤疗效。     

TRAF6和IFN-λR1相互作用后的泛素化变化对 IFN-λ1信号通路的影响

目的 研究IFN-λ1抑制NF-κB激活和TRAF6抑制ISRE激活的分子机制。方法 利用细胞培养、细胞转染、免疫共沉淀、SDS-PAGE及Western blot等方法检测IFN-λ1对TRAF6泛素化,以及泛素连接酶TRAF6对IFN-λ1的受体IFN-λR1泛素化的作用。结果 IFN-λ1会抑制TRAF6的自身泛素化,TRAF6能泛素化受体IFN-λR1,并且IFN-λ1会增加IFN-λR1与泛素K63位点的结合。结论 IFN-λ1抑制了NF-κB的激活的原因是IFN-λ1能够抑制TRAF6的自身泛素化。TRAF6能泛素化IFN-λR1,从而抑制ISRE的激活。     

PI3K-AKT-mTOR信号通路在细胞分化中的作用

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)及其下游分子AKT、TSC1/2和mTOR所组成的信号通路参与增殖、凋亡等多种细胞功能的调节。近年来发现,这一信号通路与细胞的分化密切相关。细胞分化的异常可以引起多种疾病,肿瘤就是一种分化异常的疾病,而PI3K-AKT-mTOR信号传递通路调节失常在肿瘤中最为常见,因此本文旨在综述PI3K-AKT-mTOR信号通路在细胞分化和肿瘤中的作用。