术中透视在腹膜透析置管中的临床应用

目的:探讨腹膜透析置管时术中透视预防导管功能障碍中的作用.方法:168例终末期肾衰竭(ESRF)患者非随机分组:A组(常规手术组)和B组(常规手术+术中透视组).所有患者随访时间1年.记录所有患者临床资料和置管相关并发症以及导管功能障碍的发生情况.结果:两组患者中9例出现出血性并发症(5.36％),其中出口处出血3例,切口血肿2例,血性引流液4例;膀胱穿孔和肠穿孔各1例(1.20％);透析液渗漏4例(2.38％),其中右侧胸腔积液2例,阴囊水肿2例;感染性并发症5例(2.98％),其中感染性腹膜炎1例,出口处感染4例,所有感染病例均得到控制.两组之间机械性并发症及感染性并发症发生率无显著性差异(P＞0.05).168例患者中无1例发生导管立即功能障碍,14例导管迟发功能障碍(8.33％),其中导管漂位9例(5.36％),其他原因所致5例(2.98％);11例患者导管功能障碍发生在术后30 d内,3例患者在术后30 d以后出现导管功能障碍(便秘所致).A组患者导管迟发功能障碍12例(11.65％),其中导管漂位10例(83.33％),其他原因所致2例;B组患者导管迟发功能障碍2例,1例导管漂位,1例便秘,A组患者导管迟发功能障碍发生率明显高于B组,两组之间差异有统计学意义(P＜0.05).B组患者在置管过程中导管一次性到位率为91.3％.结论:导管功能障碍是腹膜透析通路的常见并发症,术中X线透视能及时发现置管时的导管位置异常,可有效预防迟发导管功能障碍,提高腹膜透析通路建立的成功率.     

mTOR通路调控肾间质成纤维细胞活化的机制

目的 探讨mTOR信号通路在肾间质成纤维细胞增生活化过程中的调控作用,并研究其抑制剂在抗肾纤维化治疗中的可行性.方法 用8周龄雌性C57BL/6小鼠构建单侧输尿管结扎(UUO)肾间质纤维化动物模型(n=30),按数字随机法分为雷帕霉素组(n=15)及UUO组(n=15).雷帕霉素组术前1d开始腹腔注射雷帕霉素(2 mg·kg-1·d-1)至实验结束;UUO组注射生理盐水.分别于术后1、3、7、14 d处死小鼠(n=3),留肾组织进行相关检测.同时,体外实验评估雷帕霉素对TGF-β诱导鼠成纤维细胞株(NIH3T3细胞)活化的干预作用.结果 UUO小鼠肾组织中活化的肌成纤维细胞[α肌动蛋白(α-SMA)阳性]高表达mTOR通路下游效应因子pS6K.雷帕霉素显著抑制pS6K表达及肾间质中肌成纤维细胞的活化,改善肾小管间质损伤及纤维化程度.实时荧光定量PCR结果提示雷帕霉素组小鼠肾皮质组织中成纤维细胞特异蛋白1 (FSP1)、转化生长因子β(TGF-β)、结缔组织因子(CTGF)及Ⅳ型胶原蛋白基因α1 (Col 4A1)的mRNA水平显著下降.体外实验结果示TGF-β诱导小鼠成纤维细胞株( NIH3T3)的mTOR通路显著活化,并大量合成α-SMA.雷帕霉素能够明显抑制mTOR通路活性,降低细胞的纤维化活性.结论 肾间质纤维化过程中成纤维细胞内的mTOR信号通路高度活化.抑制mTOR通路能够显著降低成纤维细胞的活性,改善肾间质纤维化程度.     

SIP1在TGF—β1诱导的人腹膜间皮细胞转分化的作用

【目的】阐明Smad作用蛋白1（Smad interacting proteinl,SIP1）与转化生长因子－β1（transforming growth factor－β1,TGF-β1）诱导的人腹膜间皮细胞（human peritoneal mesothelial cells）转分化（epithelial—mesenchymal transition,EMT）的关系,探讨TGF－β1可能通过调控SIP1引起腹膜间皮细胞EMT的机制。【方法】培养的人腹膜间皮细胞株（HMrSV5）随机分为对照组（TGF-β1刺激Oh）和TGF－β1刺激组,通过western blot及realtime PCR检测细胞中E－钙粘素（E－eadherin）、紧密连接蛋白（claudinl）、波形蛋白（vimentin）及纤维连接蛋白（fibronectin,FN）在不同时间点（12h,24h,48h,72h）的表达;并通过western blot及realtime PCR检测相应时间点细胞中SIP1的表达。【结果】5ng／ml TGF－β1刺激后,HMrsV5细胞E-cadherin、claudinl蛋白及mRNA表达水平呈时间依赖性降低（P〈0．01）;vimentin、FN蛋白及mRNA表达水平呈时间依赖性升高（P〈0．01）;SIP1蛋白及mRNA表达水平呈时间依赖性上调（P〈0．01）。【结论】TGF-β1可能通过上调HMrSV5细胞SIP1表达诱导HMrSV5细胞EMT及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积,将为进一步研究腹膜纤维化的分子机制提供新的靶点。     

microRNA与肾脏疾病

1993年,Lee等^[1]在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditis elegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4,2000年Reinhart等^[2]又在该线虫中发现第二个异时性开关基因let～7。2001年10月《science》报道了三个实验室分别从线虫、果蝇和人体内找到的几十个类似于lin-4的小RNA基因,称之为microRNA。     

16年腹膜透析的基础和临床研究回顾

总结16年以来中南大学湘雅二医院肾内科腹膜透析的基础与临床研究的经验与成果。在国内率先成功构建了腹膜透析及腹膜纤维化动物模型,分离、鉴定了腹膜间皮细胞;利用细胞、分子生物学方法,系统研究了腹膜透析液的生物相容性、腹膜间皮细胞透析损伤的分子机制与防治措施,观察了促纤维化细胞因子转化生长因子-β1(TGF-β1),结缔组织生长因子（CTGF）及过氧化物酶体增生物激活受体-γ（PPAR-γ)等在腹膜纤维化发病机制中的重要作用,并初步阐明了它们的基因表达调控机制。首次在腹膜透析研究领域中利用纳米载体介导TGF-β1-shRNA与pCTGF-shRNA质粒在腹膜细胞与组织中的表达。在临床研究方面,研究了腹膜透析置管定位新方法、腹膜透析溶质转运特点及其机制、腹膜透析治疗模式及其他并发症的防治。     

腹膜透析流出液中人腹膜间皮细胞的培养及转分化特征

目的 建立从腹膜透析(PD)流出液中分离、培养人腹膜间皮细胞(HPMC)的方法,并检测上皮黏附连接蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白claudin-1及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平.方法 从25例持续不卧床腹膜透析(CAPD)患者PD流出液中分离HPMC,并在体外进行原代培养.根据开始透析的时间分为新开管组(10例)和透析半年以上组(15例).采用倒置相差显微镜、免疫组织化学染色和扫描电镜对培养的细胞进行鉴定;采用实时定量PCR检测细胞E-cadherin、claudin-1及α-SMA mRNA表达.结果 22例患者(新开管组10例,半年以上组12例)PD流出液分离的细胞在体外培养成活,经鉴定均具有HPMC的特征.实时定量PCR结果显示,半年以上组较新开管组分离的HPMC细胞E-cadherin、claudin-1 mRNA表达降低,α-SMA mRNA表达增高(P<0.05),提示出现了间充质细胞转分化(EMT).结论 该研究成功建立了PD流出液分离培养原代HPMC的方法,并证实长期PD患者HPMC存在EMT倾向.该研究的发现为进一步研究腹膜纤维化(PF)和超滤衰竭(UFF)提供了新的方法与实验依据.     

改良保存液处理红细胞对糖尿病小鼠创面愈合的影响

目的研究改良处理红细胞回输对糖尿病小鼠伤口愈合的影响,并探讨其可能的作用机制。方法建立糖尿病小鼠模型,随机分为献血组和实验组。采集献血组小鼠血液,分别用标准和改良保存液保存,在7、14、21和28 d检测红细胞(RBC)携氧能力及变形能力。在实验组小鼠背部制作伤口愈合模型,并将保存7 d的血液回输给实验组小鼠,再分为标准组及改良组,每组6只,在0、1、4、7和14 d观察小鼠伤口愈合情况,第14天处死小鼠,取创面皮肤组织进行HE、Masson染色,免疫组化方法对伤口组织的纤维化程度进行分析,Western blot检测伤口组织PI3K/AKT、MEK/ERK及其磷酸化蛋白水平。结果与标准组比较,改良组游离血红蛋白(fHb)含量降低,而P50、pH、2,3-二磷酸甘油酸(2,3-DPG)和红细胞变形性(RCD)升高(P0.05);改良组创面面积显著减小、皮肤组织和血管面积增加、胶原纤维的表达和纤维化程度升高(P0.05)。小鼠伤口组织中HIF-1α、VEGF和EGF浓度水平增加(P0.05)。PI3K/AKT、MEK/ERK表达增加,PI3K/AKT和MEK/ERK磷酸化显著增强(P0.05)。结论改良保存液处理的红细胞可能通过激活HIF-1α信号通路促进糖尿病小鼠的伤口愈合。     

贮存式自体全血与单纯红细胞输注对家兔骨髓造血干细胞功能的影响

目的探讨贮存式自体全血和红细胞成分对骨髓造血干细胞衰老相关指标的影响。方法健康雄性新西兰家兔30只,3~6月龄,体重2.5~3.0 kg。采用随机数表法将其分为五组:对照组(C组)、单纯手术组(S组)、手术采血组(ABS组)、贮存式自体全血输注组(PAB组)和贮存式自体红细胞输注组(PARB)组,每组6只。C组家兔麻醉后,不做任何处理,按时点采集骨髓标本,其余各组均开腹行肝叶切除,ABS组、PAB组和PARB组于术前1周采血贮存,S组和ABS组术中输液补充血容量,PAB组和PARB组术中分别输注贮存的自体全血和自体红细胞。于麻醉诱导后手术前(T₁)、术后6 h(T₂)和术后24 h(T₃)采集骨髓样本测定家兔CD34⁺细胞百分比、活性氧(ROS)浓度、衰老细胞比例及衰老相关蛋白(p53、p21)的表达情况。结果与T₁时比较,T₂、T₃时S组、ABS组、PAB组和PARB组的CD34⁺细胞百分比明显升高,ROS浓度、衰老细胞比例明显降低,T₂时ABS组,T₂、T₃时S组、PAB组和PARB组p53、p21蛋白含量明显降低(P<0.05)。与T₂时比较,T₃时S组、ABS组、PAB组和PARB组的CD34⁺细胞百分比明显升高,T₃时PARB组衰老细胞比例明显降低,T₃时ABS组、PAB组和PARB组p53蛋白含量明显升高,T₃时ABS组和PAB组p21蛋白含量明显升高(P<0.05)。与C组比较,T₂、T₃时S组,T₁—T₃时ABS组、PAB组和PARB组的CD34⁺细胞百分比明显升高,ROS浓度、衰老细胞比例及p53、p21蛋白含量明显降低(P<0.05)。与S组比较,T₁时ABS组,T₁—T₃时PAB组和PARB组CD34⁺细胞百分比明显升高,T₁—T₃时ABS组、PAB组和PARB组的ROS浓度明显降低,T₁、T₂时ABS组,T₁—T₃时PAB组和PARB组衰老细胞比例和p53、p21蛋白含量明显降低(P<0.05)。与ABS组比较,T₂、T₃时PAB组和PARB组的CD34⁺细胞百分比明显升高,T₁—T₃时PAB组和PARB组的ROS浓度明显降低,T₂、T₃时PAB组和PARB组衰老细胞比例和p53、p21蛋白含量明显降低,T₁时PARB组p53、p21蛋白含量明显升高(P<0.05)。与PAB组比较,T₃时PARB组的CD34⁺细胞百分比明显升高,T₂、T₃时PARB组的ROS浓度明显降低,T₂时PARB组的衰老细胞比例明显降低(P<0.05)。结论贮存式自体输血在一定程度逆转骨髓细胞衰老表型,促进CD34⁺细胞生成,从造血干细胞的角度而言,采集并输注红细胞成分比全血更加有益。     

贮存式自体成分输血对胃肠肿瘤患者围术期免疫功能的影响

目的观察贮存式自体成分输血与异体输血对胃肠恶性肿瘤患者围术期细胞免疫和体液免疫的影响。方法选择择期全麻下行胃肠肿瘤根治手术患者60例,男33例,女27例,年龄53~69岁,体重47~70 kg,ASAⅠ或Ⅱ级。术中出血200~400 ml,Hb70 g/L时启动输血,将患者随机分为两组,每组30例。贮存式自体成分输血组(P组):术中输血时采用贮存式自体成分输血;异体输血组(A组):输血时采用异体输血。测定入室时、术毕即刻、术后1、3、7 d外周血中T淋巴细胞亚群、NK细胞百分比和IL-2、IL-10、TNF-α、穿孔素(perforin,PF)浓度。结果与入室时比较,术毕即刻至术后7 d A组CD3~+、CD4~+、NK细胞百分比和CD4~+/CD8~+比值明显降低(P0.05);术后3、7 d A组CD3~+、CD4~+、NK细胞百分比和CD4~+/CD8~+比值明显低于P组(P0.05);术后1~7 d A组IL-2浓度明显低于,IL-10浓度明显高于P组(P0.05)。与入室时比较,术毕即刻至术后3 d A组Ig G、Ig A含量明显降低(P0.05);术毕即刻P组Ig G、Ig A含量明显降低(P0.05),术后1、3 d恢复至术前水平。结论围术期异体输血可降低肿瘤患者T细胞亚群和NK细胞百分比并延长其恢复时间,也可一过性降低血浆中免疫球蛋白Ig G、Ig A含量,从而影响患者的免疫功能,而贮存式自体成分输血对肿瘤患者术后免疫功能的影响轻微。     

腹膜透析引流液离心法和大网膜消化法原代培养人腹膜间皮细胞

[目的]建立和改善两种人腹膜间皮原代细胞培养的方法.[方法]分别采用离心法从腹膜透析（PD）引流液中及胰蛋白酶-EDTA消化法从人的腹膜组织中分离培养人腹膜间皮细胞（HPMC）,并分别对两种原代培养的HPMC采用相差倒置显微镜和免疫组化染色对培养的细胞进行鉴定.[结果]①两种方法均在体外原代培养成活,在相差倒置显微镜下观察细胞均呈典型的铺路石样外观,免疫组化显示两种方法培养的HPMC胞浆角蛋白、波形蛋白表达阳性,提示为腹膜间皮细胞.②经大网膜消化法获得的HPMC可传至第四代,保持原有铺路石样外观,PD引流液离心法获得的HPMC传代后生长缓慢,长期接受PD后HPMC可呈现成纤维细胞样改变.[结论]成功应用离心法和消化法进行HPMC原代培养,有助于PD研究体外实验的开展.