脑胶质瘤白细胞介素-6自分泌或旁分泌环路的研究

目的　研究白细胞介素 6(IL 6) /IL 6受体 (IL 6R)自分泌或旁分泌环路与脑胶质瘤的关系。方法　采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)方法检测IL 6和IL 6R基因在 4株脑胶质瘤细胞株、62例脑胶质瘤组织标本、5例良性脑膜瘤组织和 5例人正常脑胶质细胞中的表达 ;将IL 6单抗 (McAb)或IL 6RMcAb与脑胶质瘤细胞共同孵育 ,四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法检测对细胞生长的抑制作用。结果　脑胶质瘤细胞株C6、9L、U 2 5 1和SHG44均有IL 6和IL 6R的表达 ,脑胶质瘤组织标本中 47例 (75 .81% )表达IL 6、5 2例 (83 .87% )表达IL 6R、41例 (66.13 % )同时表达IL 6和IL 6R ;良性脑膜瘤组织 4例表达IL 6,人脑正常胶质细胞仅有IL 6弱表达 ,两者均无IL 6R表达。IL 6McAb和IL 6RMcAb能够显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖 ,并存在剂量依赖关系(P <0 .0 1)。结论　脑胶质瘤很可能存在IL 6/IL 6R自分泌或旁分泌环路 ,阻断此环路可以明显抑制胶质瘤细胞的恶性增殖     

PPARγ在不同周龄apoE-/-小鼠主动脉斑块表达及与斑块成份的相互关系

目的:研究PPARγ基因表达与ApoE-/-小鼠主动脉斑块成份的相互关系。方法:以20和40周龄ApoE-/-小鼠(n=10/组)为研究对象,相同基因背景和周龄C57BL/6 J小鼠设为对照。采用RT-PCR和免疫印迹技术检测各组小鼠主动脉PPARγ基因和蛋白表达变化;Movat 5色套染法和油红O染色检测ApoE-/-小鼠主动脉斑块成份;免疫组织化学技术检测斑块内PPARγ、SM-actin、MOMA-2抗原表达。结合免疫荧光技术分析PPARγ基因在主动脉斑块巨噬细胞、平滑肌细胞的表达及与脂质、弹性纤维、胶原和蛋白聚糖的相互关系。结果:20和40周龄C57BL/6 J小鼠主动脉壁有少量PPARγ表达,以20周龄组明显。ApoE-/-小鼠主动脉壁和斑块内PPARγ表达增多,以斑块内表达明显(P<0.05);与20周龄组比较,40周龄组表达最显著;且斑块脂质含量丰富;弹性纤维、胶原和蛋白聚糖含量减少,血管正性重塑明显;MOMA-2表达增加,SM-actin表达降低(P<0.05)。PPARγ在斑块内巨噬细胞、血管中膜平滑肌细胞和斑块内平滑肌细胞都有表达,但以脂质含量丰富处PPARγ表达最明显。结论:PPARγ在C57BL/6 J小鼠动脉壁表达随增龄而减少;在ApoE-/-小鼠主动脉壁和斑块内PPARγ表达随AS病变进程而增加。推测ApoE-/-小鼠主动脉斑块PPARγ表达上调可能是机体一种代偿行为和自我保护机制。     

膜型/分泌型MICA对NK细胞受体NKG2D的相反调节效应及其对NK细胞受体谱的影响

目的　观察膜型和分泌型MICA对NK细胞受体表达的影响 ,以探讨NK细胞抗肿瘤活化机制及肿瘤细胞表达MICA分子的意义。方法　用MTT法测定人NK细胞系 (NK92 )的细胞毒活性 ;用RT PCR或FACS检测NK细胞受体 (NKG2D ,NKG2A B ,KIR2DL1,KIR2DS1)及NKG2D的识别配体MICA的表达。结果　肿瘤细胞表面的MICA分子可上调NKG2D的表达 ,下调抑制性受体NKG2A B和KIR2DL1的表达 ;而分泌型MICA (sMICA)分子对NKG2D及抑制性受体的表达均有抑制作用。结论　膜型MICA分子可上调NKG2D的表达 ,激发NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒效应 ;分泌型MICA分子则通过降低NKG2D的表达下调机体的抗肿瘤免疫效应 ,肿瘤细胞分泌sMICA分子为肿瘤发生免疫逃逸的机制之一。     

人肿瘤细胞中Th2类细胞因子的逆转与NK抗性变化的研究

正常状况下,机体的Th1/Th2类细胞因子处于一种平衡状态,IFN-γ、IL-2和Th2类细胞因子单克隆抗体促进向Th1型发育,IL-4和抗IFN-γ单抗促进向Th2方向分化.我们选择人肿瘤细胞株为研究对象,发现肿瘤细胞存在Th2类细胞因子表达强势状态,推测可能为肿瘤细胞免疫逃逸的机理之一,为调整肿瘤细胞所处的状态,调动细胞免疫反应,我们采用 IFN-γ、IL-12和抗 IL-10 McAb进行不同的组合,对典型的Th2型肿瘤细胞株Karpas淋巴瘤进行了促逆转的研究.     

EGFP Kallikrein重组真核表达载体的构建及其在兔内皮祖细胞中的表达

目的：构建携带人组织激肽释放酶（tHK）基因，以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入内皮祖细胞(EPCs)中表达，验证tHK基因修饰EPCs用于血管病治疗的可行性。方法：PCR扩增tHK目的基因，将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP N3上，构建重组质粒载体。并利用脂质体转染体外培养的EPCs，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察tHK EGFP融合蛋白在细胞中的表达；用RT PCR 方法验证tHK在mRNA水平的表达；用ELISA方法验证tHK蛋白水平的表达。结果：酶切和测序证实pEGFP Kallikrein重组质粒构建正确，重组质粒载体在EPCs 中获得了表达,表达的融合蛋白具有tHK 和EGFP 的双重活性。结论：通过基因克隆方法成功构建了pEGFP Kallikrein重组质粒载体，并且在EPCs 中稳定表达，为进一步研究tHK基因修饰EPCs双重治疗血管病的技术策略奠定了基础。     

压力容量超负荷大鼠模型右心室重塑过程中细胞间质的改变

目的：通过人工套接大鼠右侧颈动静脉，造成左向右分流，导致大鼠右心室压力容量负荷增加，从多个不同层面研究大鼠右心室重塑过程中细胞间质的变化。方法：设4个实验组与4个对照组，每组10只体重、性别相匹配的近交系Wistar大鼠。实验组无菌手术套接大鼠右侧颈总动脉与颈外静脉，造成左向右分流，于术后1、2、4、8周分别测定动物体重(BW)，右心室与左心室加室间隔质量之比［R/(L+S)］及右心室质量与体重之比(RV mg/BW g)；右心室组织切片，普通光镜下观察组织学的改变，并利用计算机形态学分析软件分析细胞与间质的改变；提取右心室心肌组织中mRNA，应用RT PCR法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原、纤维结合素Ⅰ基因表达量的变化。对照组手术操作同试验组，唯不套接动静脉，同样条件饲养。结果：术后第1周开始，试验组大鼠右心室压力即明显高于对照组，术后第1、2、4、8周之间相比，无统计学意义。试验组大鼠（RV mg/BW g）在术后8周时有统计学意义（0.64±0.05 vs 0.43±0.03，P＜0.01）; R/(L+S)至第8周时也有类似变化（0.36±0.04 vs 0.21±0.02，P＜0.05 ）；所有试验大鼠均未发生心衰现象，与对照组相比，Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达量在第1、4、8周时改变不明显，第2周时有统计学意义(Ⅰ型胶原：0.93±0.18 vs 0.79±0.07，P＜0.05；Ⅲ型胶原：0.43±0.07 vs 0.36±0.07，P＜0.05。平均光密度法)。纤维结合素Ⅰ第1周时即可检测到mRNA表达量升高，与对照组相比有统计学意义（0.26±0.06 vs 0.20±0.05，P＜0.05）；第2、4、8周时与对照相比无统计学差异。结论：①压力容量负荷改变能够引起大鼠右心室的重塑，包括心肌细胞和细胞周围基质，不同的改变可以有不同的时间特征，并和右心室压力有明显相关性；②反映细胞周围基质改变的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维结合素Ⅰ基因在改变的早期出现明显改变，说明右心室重塑是机体对外界环境改变积极适应的结果。     

重组人白细胞介素15工程菌高密度发酵条件探讨

目的研究表达重组人白细胞介素15(rhIL-15)工程菌高密度发酵的条件。方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白质表达的因素进行优化。结果以甘油为碳源可明显抑制有害物质乙酸的积累,提高工程菌的表达量和收获率。高密度发酵明显提高了目的蛋白质的表达量和工程菌的产量。结论该发酵工艺大大提高了rhIL-15工程菌的产量和表达水平,为rhIL-15的规模化生产打下了基础。     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

人1igatin样基因HCA56的克隆及其生物信息学分析

目的 利用SEREX方法筛选人肝细胞癌(HCC)cDNA表达文库，克隆能引起机体体液免疫应答的抗原编码基因，并对其进行生物信息学分析，以指导对新克隆基因功能的研究。方法采用ZAP—cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning试剂盒构建人HCC cDNA表达文库，用患者自体血清进行筛选，对筛选得到的阳性克隆进行序列测定。通过生物信息学对筛选得到的阳性克隆HCA56进行染色体定位、基因结构分析、蛋白序列预测以及相似性搜索和功能分析。逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)检测HCA56的组织表达谱。结果 通过对一个cDNA表达文库的筛选，获得了一个血清反应阳性克隆HCA56，全长2021bp，编码584个氨基酸，定位于染色体1q31～q32。数据库搜寻表明它与人ligatin编码基因片段有95％的相似性。RT—PCR显示HCA56广泛分布于各种正常组织。结论 HCA56很可能是ligatin的全长编码基因，生物信息学与分子生物学相互结合是进行新基因研究的有效方法。     

肥厚型心肌病肌球蛋白结合蛋白C基因突变研究

肥厚型心肌病（HCM）是以左心室和（或）右心室及室间隔非对称性肥厚为特征的一组疾病．属常染色体硅性遗传疾病．该病约有55％发病呈家旗聚集性。分子遗传学研究证实HCM是一种基因多态性疾病，编码肌小节结构蛋白的基因突变与其有关．数个基因中一个发生突变即可致病。目前，已发现了可以导致HCM的许多基因突变，包括编码可收缩肌小节的11个基因，超过200余种不同突变。