嗜麦芽窄食单胞菌Smqnr耐药基因的序列分析及原核表达

目的:对嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株gzch770(SMgzch770)携带的喹诺酮耐药基因Smqnr进行扩增、测序及原核表达,为研究Smqnr蛋白的功能奠定基础。方法:提取SMgzch770基因组染色体,PCR扩增Smqnr全基因并克隆入pMD18-T载体进行核苷酸序列分析;将Smqnr基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况。结果:以染色体DNA为模板,成功扩增660bpSmqnr基因;序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性达98%以上;SMgzch770Smqnr序列已登录GenBank(登录号:HQ315851);SDS-PAGE显示,融合基因表达的蛋白约为50kDa,其中Smqnr蛋白约为24kDa。结论:从SMgzch770中成功克隆及表达了Smqnr基因,为进一步进行Smqnr蛋白高级结构测定的结晶试验提供了必须材料。     

肠道病毒71型VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的 对肠道病毒71型VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法 根据GenBank中EV71序列设计一对特异性引物,以EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板,RT-PCR扩增EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体pET28a。构建pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化E.coli DH5α,IPTG诱导表达,使用SDS-PAGE及Western blot分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用ELISA分别检测EV71阳性与COX A16阳性患者VP-1IgG抗体,进行统计学分析。结果 目的基因经BLAST比对,同源性与GenBank登录号为JQ766207.1 EV71 VP1一致性达99%。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×103,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA结果显示EV71阳性患者OD值为(2.425±0.521),COX A16阳性患者OD值为(1.205±0.314),健康对照组OD值为(0.353±0.128)。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84%和88%。结论 成功构建了pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行ELISA初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于EV71诊断及疫苗的相关研究。     

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白（NAP）基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础.方法：根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析.结果：以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2％,IPTG诱导后,pGEX4T-1-NAP/BL21在相应分子量（42.8 kD）可见融合蛋白的表达.幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1 NAP序列已登录GenBank（登录号：GU301881）.结论：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础.     

嗜麦芽窄食单胞菌产氨基糖苷类修饰酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ的克隆与表达

目的对嗜麦芽窄食单胞菌临床分离株gzch810(SM gzch810)携带的产氨基糖苷类修饰酶基因APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ进行扩增、测序及原核表达,为下一步功能试验的开展提供基础材料。方法提取SM gzch810基因组染色体,PCR扩增APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ全基因并克隆入pMD18-T载体进行核苷酸序列分析;将APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况。结果以染色体DNA为模板,成功扩增800bp APH(3′′)-Ⅰ基因和550bp AAC(2′)-Ⅰ基因;序列比对分析显示其与相关报道序列核苷酸和氨基酸一致性分别达91%及95%;SM gzch810APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ序列已登录GenBank(登录号:HQ315852和HQ315853);SDS-PAGE显示,融合基因表达的蛋白相对分子质量分别约为56×103和46×103。结论从SM gzch810中成功克隆及表达了APH(3′′)-Ⅰ和AAC(2′)-Ⅰ基因,为下一步检测上述两种重组体大肠杆菌对相应抗菌药物的耐药性及其功能评价做好准备。     

肠道病毒71型 VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析

目的：对肠道病毒71型 VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化,初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据 GenBank 中 EV71序列设计一对特异性引物,以 EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板, RT-PCR 扩增 EV71 VP1基因,酶切后插入表达载体 pET28a。构建 pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化 E．coli DH5α,IPTG诱导表达,使用 SDS-PAGE 及 Western blot 分析表达结果,利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板,用 ELISA 分别检测 EV71阳性与 COX A16阳性患者 VP-1 IgG 抗体,进行统计学分析。结果目的基因经 BLAST 比对,同源性与 GenBank 登录号为 JQ766207．1 EV71 VP1一致性达99％。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×10^3,主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出,EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白,无跨膜区,不具有 N-端信号肽序列,存在三级结构。ELISA 结果显示EV71阳性患者 OD 值为（2．425±0．521）,COX A16阳性患者 OD 值为（1．205±0．314）,健康对照组 OD 值为（0．353±0．128）。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84％和88％。结论成功构建了 pET28a-EV71 VP1表达载体;通过对手足口患者血清进行 ELISA 初步分析,得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性,初步证实具有生物学活性,可进一步用于 EV71诊断及疫苗的相关研究。     

2010年广州某医疗中心儿童夏季细菌性腹泻的病原学调查

目的研究广州地区小儿夏季细菌性腹泻的病原菌分布。方法采集2010年5～7月广州市妇女儿童医疗中心珠江新城院区腹泻患儿的大便标本进行常规病原菌的分离培养,通过生化反应和血清凝集试验进行鉴定和分型,并使用金标法对空肠弯曲菌抗原进行检测。结果从110份标本中检出44株病原菌,检出率为40.0%。其中致病性大肠埃希菌17株,2岁以下患儿检出15株;空肠弯曲菌12株,2岁以下患儿检出10株;沙门菌6株;念珠菌纯生长6株;产气荚膜杆菌3株。结论广州地区夏季儿童细菌性腹泻的主要病原菌是致病性大肠埃希菌及空肠弯曲菌,两者的易感人群以2岁以下婴幼儿为主。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A(SEA)基因,亚克隆入表达载体pET-28a(+),诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a(+)-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a(+)-SEA/BL21在相应分子量(约30000Mr)条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆及原核表达

目的从分离培养的金黄色葡萄球菌中提取肠毒素A（SEA）基因,亚克隆入表达载体pET-28a（＋）,诱导融合蛋白的表达,为肠毒素A应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEA的序列,设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌DNA为模板PCR扩增SEA,纯化DNA进行BamHⅠ、XholⅠ双酶切鉴定及测序鉴定,并与做相应酶切的pET-28a（＋）连接,转化大肠杆菌BL21,并对质粒进行双酶切鉴定及基因序列分析,用IPTG诱导融合蛋白的表达,His标签单克隆抗体进行免疫印迹验证融合蛋白的表达。结果以金黄色葡萄球菌DNA为模板,成功扩增了SEA基因,基因大小为774bp,重组PET-28a（＋）-SEA双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEA在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99.9%。经IPTG诱导后,SDS-PAGE可见pET-28a（＋）-SEA/BL21在相应分子量（约30000Mr）条带大量表达,免疫印迹能检测到目的蛋白条带,说明其与His标签融合表达。结论克隆了金黄色葡萄球菌SEA基因,并成功在大肠杆菌BL21中融合表达,为肠毒素A应用研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌临床分离株尿素酶基因B的原核表达、纯化及免疫活性

目的:在大肠杆菌中表达幽门螺杆菌临床分离株尿素酶B(UreB),纯化重组蛋白并分析其免疫活性.方法:将pGEX-4T-1-UreB重组菌BL21复舒,挑单菌落接种于含氨苄的LB培养基中.0.5 mmoL异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,使用纯化的重组蛋白免疫小鼠.ELISA检测血清抗体效价,并使用感染患者血清进行Western-blotting鉴定重组蛋白反应原性.结果:SDS-PAGE示在约87 kD相应分子量可见融合蛋白表达,产物主要在表达上清以可溶形式存在,纯化蛋白免疫小鼠能诱导产生特异性体液免疫应答,ELISA检测特异性IgG效价为1:51 200.Western blotting示重组蛋白能被幽门螺杆菌感染患者血清识别.结论:UreB在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有较好的免疫原性及反应原性.