Ezrin shRNA联合HSP70对骨肉瘤细胞凋亡和增殖的影响

 目的 探讨Ezrin基因沉默联合热休克蛋白（heat shock protein, HSP）70诱导的免疫杀伤对骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法 采用人成骨肉瘤MG63细胞系作为研究对象,将人HSP70和Ezrin-shRNA的DNA片段分别克隆至含CMV和pU6双启动子的表达载体pGFP-V-RS中构建含HSP70和Ezrin-shRNA的真核表达载体pGFP-V-RS-shRNA和pGFP-V-RS-shRNA-HSP70。重组质粒分别转染入细胞,筛选出稳定表达的细胞克隆。荧光显微镜观察细胞形态及转染效果;荧光定量RT-PCR及蛋白印迹western blot检测稳定转染细胞株Ezrin和HSP70基因及蛋白水平的变化;采用MTT、流式细胞术检测细胞增殖、凋亡能力变化,Western blot检测凋亡及周期相关蛋白表达量变化;MTT法检测HSP70刺激产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对靶肿瘤细胞的杀伤作用。结果 荧光图像及基因和蛋白表达分析证实,首次成功构建同时沉默Ezrin和过表达HSP70的特异性载体。较单纯沉默Ezrin,同时过表达HSP70会在一定程度上减弱沉默Ezrin蛋白促进细胞凋亡和抑制增殖的效果,但与对照细胞相比,M63细胞凋亡率仍明显上升,自11.01%±0.22%上升至24.28%±0.50%,增殖速度则自395.14%±2.24%减少至310.00%±2.83%。另外,Western blot检测发现Ezrin-shRNA可促进凋亡基因Bax的表达,相反可降低抗凋亡基因Bcl-2和细胞周期蛋白Cyclin D1的表达。而Ezrin-shRNA/HSP70组较Ezrin-shRNA组促Bax表达和降低Bcl-2、细胞周期蛋白Cyclin D1表达有所减弱,但较阴性对照组仍有明显效果。MG63细胞的CTL细胞毒杀伤效应显示各效靶浓度下CT+IL-2+HSP70组的杀伤活性高于CT+IL-2组,最高达56.33%±1.95%。结论 同时沉默Ezrin、过表达HSP70既可以促进骨肉瘤细胞凋亡抑制其增殖,并利用HSP70诱导的CTL,增强对靶肿瘤细胞的杀伤作用。     

体外RNA干扰抑制Ezrin表达对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的影响

背景与目的:细胞膜-细胞骨架联接蛋白(埃兹蛋白,Ezrin)参与了许多细胞的功能,包括细胞黏附、细胞运动以及细胞的生存.最近的许多研究表明Ezrin参与调控了肿瘤的侵袭与转移.然而,在骨肉瘤中,Ezrin所扮演的重要角色还没有被很清晰的阐明.本研究拟探讨Ezrin蛋白对人骨肉瘤细胞增殖和侵袭能力的影响.方法:以骨肉瘤MG-63细胞系为研究对象,针对Ezrin编码基因设计小干扰RNA片段,重组其shRNA(short hairpin RNA)表达载体转染入细胞,筛选稳定表达的克隆,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(Western-Blot)方法检测转染后Ezrin的mRNA和蛋白的表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell法检测侵袭能力的变化.结果:RT-PCR和Western blot检测显示shRNA对Ezrin在基因和蛋白水平均有显著下调作用.骨肉瘤细胞生长速度减慢,处于分裂期的细胞比例有明显的下降,由25.05%下降到18.36%,而G1期细胞比例则由60.57%上升到67.65%.穿过人工基底膜的细胞数量也明显减少,由35.9±5.6减少为22.5±2.8(P＜0.01).结论:Ezrin在骨肉瘤的增殖和侵袭过程中发挥有重要作用,可能成为抑制肿瘤增殖和转移的关键性分子.     

体外小儿骨髓间充质干细胞对牵张应力早期应答反应的研究

目的 观察体外小儿骨髓间充质干细胞(MSCs)对周期性牵张应力的早期应答反应.方法 分离并培养小儿MSCs,利用体外细胞牵张应力装置对第三～六代细胞加载短期力学信号,检测各组细胞内Oa2+以及早期反应基因蛋白(c-fos、c-jun和c-myc)的表达情况.结果 应力干预MSCs后,细胞内Ca3+浓度在受力1min后即增高,荧光强度是对照组的164.63%,3、5min升高更明显,干预10 min后Ca2+浓度升高的幅度有下降趋势;c-fos、c-jun和c-myc基因蛋白在未受力组细胞内不表达或微量表达,加载力学信号后,表达发生了明显的变化,随时间的延长,均表现为增强-持续-回复原来水平.结论 周期性牵张应力影响MSCs内Ca2+的浓度及早期反应基因蛋白(c-fos、c-jun和c-myc)的表达,推测c-fos、c-jun和c-myc参与了MSCs响应力学的信号传导途径,可能依赖Ca2+通道的活化来调控.     

寰椎椎弓根钉内固定通道的三维CT影像学研究

目的利用三维影像学探讨常人寰椎椎弓根钉内固定通道的解剖学基础。方法从本院PACS系统中随机选取60例头颈部CTA枕寰枢复合体无明确异常的影像学资料,进行回顾性三维CT成像。测量相关解剖学数据,以颈椎扩孔器横截面面积(3~5 mm2)为对照,归纳出3种椎弓根类型。结果 60例头颈部CTA三维图像显示寰椎及周围结构清楚,测量出寰椎椎动脉沟底部后弓外径高度男性(4.39±1.16)mm,女性(3.84±0.84)mm,小于常规螺钉直径(3.50 mm)占27.7%;在寰椎椎弓根通道分型中,Ⅰ型68侧,占56.67%,Ⅱ型25侧,占20.83%;Ⅲ型27侧,占22.50%;皮质骨面积比例随通道面积的减小而增大,在各型椎弓根通道都在80%以上。结论寰椎椎动脉沟底部后弓外径高度是制约寰椎椎弓根钉固定的重要因素,而寰椎椎弓根骨性通道的解剖结构特点则影响置钉技术的选择;设计出适应寰椎椎动脉沟底部后弓外径高度的螺钉是非常必要的。     

微型钛板在颈椎后路椎板成形中的应用：近期随访

背景：颈椎后路单开门椎管扩大成形术治疗多节段颈椎病时,椎管发生再狭窄、颈椎生理曲度的丢失、轴性症状的发生是影响疗效的重要原因,持久维持椎管的扩大状态和减少颈椎后部组织结构的干扰在临床治疗中非常有必要。目的：观察微型钛板置入内固定在颈椎后路单开门椎管扩大成形治疗过程中的临床效果及近期随访结果。方法：回顾性分析厦门大学附属中山医院2006年4月至2013年4月具有完整资料的采用颈椎后路单开门椎管扩大成形术治疗脊髓型颈椎病的患者共67例,其中微型钛板组27例使用微型钛板置入内固定,缝线组40例采用传统缝线悬吊“门轴”。两组的减压节段均为C3-7。比较两组手术时间、术中出血量、随访时JOA评分改善率、颈椎曲度变化值、轴性症状及椎板掀开角度。结果与结论：两组手术时间、术中出血量、JOA评分改善率差异均无显著性意义（P〉0.05）。两组曲度变化值,术后6个月微型钛板组颈椎曲度丢失不明显,缝线组颈椎曲度部分丢失（P〈0.05）,两组差异有显著性意义（P〈0.05）。术后6个月轴性症状发生率微型钛板组明显低于缝线组（P〈0.05）。末次随访时椎板开门角度微型钛板组（35.2±6.2）°与缝线组（34.0±4.7）°比较差异无显著性意义（P〉0.05）。提示颈椎后路单开门椎管扩大成形治疗脊髓型颈椎病,使用微钛板与传统缝线悬吊固定方法,均能获得较好的临床效果,但微型钛板固定法能减轻术后的轴性症状以及防止颈椎曲度丢失。     

壳聚糖/纳米羟基磷灰石分层复合支架的生物相容性研究

制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CS/nHA)分层复合支架,对其进行细胞毒性评价.分离培养大鼠软骨细胞接种于支架,相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附及生长情况.动物皮下埋植试验观察其组织相容性.实验结果证实壳聚糖/纳米羟基磷灰石分层复合支架具有良好的生物相容性,有望成为较好的骨软骨组织工程支架.     

下调人高迁移率族蛋白1对人前列腺癌细胞PC-3的影响

目的研究小干扰RNA(siRNA)抑制高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因对PC-3侵袭和转移的影响。方法构建真核表达载体Pgenesil-1/HMGB1siRNA,转染PC-3细胞系,通过RT-PCR和Western blot检测HMGB1的mRNA及蛋白;通过细胞划痕、transwell和明胶酶谱分析检测PC-3体外侵袭能力。结果成功构建siRNA表达载体Pgene-sil-1/HMGB1siRNA,可使PC-3细胞HMGB1mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),并能有效抑制PC-3体外侵袭和转移活性(P<0.05)。结论应用siRNA技术能有效的抑制基因的表达,同时也能有效抑制PC-3细胞的体外侵袭和转移,为肿瘤的生物学治疗提供了新思路。     

鼠骨骺干细胞免疫纯化和pTRE-PTHrP(38-94)反应质粒的构建

目的 免疫纯化新生大鼠骨骺干细胞,克隆甲状旁腺相关蛋白的中间片段PTHrP(38-94)基因并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP(38-94).方法 采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的骨骺干细胞,分别以FGFR-3抗体和PCNA抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定.提取骨骺干细胞的总RNA,以RT-PCR方法获得带有酶切位点PTHrP(38-94)基因片段,扩增的DNA片段与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接,转化、扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定.结果 免疫荧光证实所取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞;经限制性内切酶Barn H I、Not Ⅰ酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的 基因已经插入重组质粒.结论 运用显微取材和免疫纯化技术可以成功分离纯化骨骺干细胞;成功克隆PTHrP(38-94)基因并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(38-94),为进一步明确PTHrP(38-94)片段的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础.     

下调Ezrin表达对前列腺癌细胞增殖和运动能力的影响

 目的研究Ezrin蛋白对前列腺癌细胞增殖和运动能力的影响。方法采用前列腺癌PC-3细胞系作为研究对象,针对Ezrin蛋白的编码序列设计小干扰RNA片段,重组为shRNA表达载体转染入细胞,筛选出稳定表达的细胞克隆,RT-PCR和Western blot分别检测Ezrin在基因和蛋白水平表达的变化,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测增殖能力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell法检测侵袭能力的变化。结果PCR和Western blot显示shRNA对Ezrin在基因和蛋白水平均有显著的下调作用,转染后的前列腺癌细胞生长速度明显减慢,细胞周期显示处于分裂期的细胞比例由(24.58±4.23)%下降到(18.65±2.21)%,处于G1期的细胞数量则由(58.69±3.48)%上升到(66.54±4.13)%。穿过人工基底膜的细胞数量也由(38.6±5.4)减少为(24.5±2.7)(P<0.01)。结论Ezrin对于前列腺癌细胞的增殖和运动能力有重要影响,可能成为肿瘤治疗的重要靶点。     

新型寰椎内径锥形螺钉的设计与拔出力的测试

目的比较两种设计的寰椎椎弓根钉的最大拔出力,为临床选择寰椎推弓根钉类型提供生物力学依据。方法设计制作两种寰椎椎弓根钉,根据螺纹部分分为皮质骨螺钉(A型螺钉)、内径锥形螺钉(B型螺钉),利用24节新鲜猪寰椎标本,置入两种类型的椎弓根钉,进行拔出试验,测定每种螺钉的最大拔出力,进行统计学分析比较。结果同一长度,不同设计的螺钉抗拔出力接近,均无显著性差异;同一直径两种设计的螺钉,28 mm比26 mm的抗拔出力略大,但均无显著性差异。结论新型寰椎内径锥形螺钉(3.0 mm)抗拔力高,螺钉根部强度好,抗弯曲、断裂性能好,可提供足够的即刻稳定性,是寰椎椎弓根固定的理想螺钉类型。