重组质粒pEGFP-C1-STAT6的构建及在HeLa细胞中表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)为报告基因的重组质粒pEGFP-C1-STAT6,观察其在HeLa细胞中的表达.方法 以重组质粒pCLNEO-STAT6为模板,PCR法扩增出目的 基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-C1上,构建重组质粒pEGFP-C1-STAT6,脂质体法转染HeLa细胞,Western 印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位和分布.结果 成功构建质粒pEGFP-C1-STAT6,并在HeLa细胞中实现表达;Western 印迹检测到融合蛋白EGFP-STAT6;在荧光显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位.结论 重组质粒pEGFP-C1-STAT6构建成功,可用于标记STAT6蛋白,为进一步研究STAT6在信号转导中的作用机制奠定基础.     

NNMT基因启动子双荧光素酶报告系统的构建及其与SND1靶向关系的验证

目的:构建尼克酰胺-N-甲基转移酶（NNMT）启动子区的双荧光素酶报告质粒并检测其活性,从而验证SND1蛋白对NNMT基因的调控作用。方法:根据NNMT基因启动子区上、下游-1 500至+200区间的序列设计引物,并以HepG2细胞提取的RNA逆转录得到cDNA为模板进行PCR扩增,得到的NNMT启动子区片段经酶切后连接到双荧光素报告载体GLuc-ONTM启动子报告克隆中,得到Gluc-NNMT 启动子重组质粒,分别与pLVX-IRES-Puro-Flag-SND1质粒和pLVX-IRES-Puro-vector质粒共同转染HeLa细胞,并检测启动子活性。然后用免疫共沉淀的方法验证NNMT蛋白是否与SND1蛋白之间存在相互作用。结果:重组质粒构建成功。双荧光素酶活性实验显示,共转染Gluc-NNMT启动子重组质粒和pLVX-IRES-Puro-Flag-SND1过表达质粒的实验组与对照组相比,NNMT启动子区活性明显增强。结合免疫共沉淀实验结果,证明NNMT与SND1存在相互作用。结论:成功构建了NNMT启动子双荧光素酶报告质粒,SND1对NNMT启动子活性有增强作用,SND1与NNMT蛋白之间存在相互作用。     

重组pEGFP-C2-p100质粒构建及表达

目的:将人类p100基因定向连入pEGFP-C2质粒,使p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究p100蛋白的功能及定位奠定实验基础.方法:采用EcoR I和BamH I双酶切方法,从pSG5-p100质粒中获得p100蛋白的cDNA全长;将该cDNA连接入pEGFP-C2质粒.将构建成功的pEGFP-C2-p100质粒转染入HeLa细胞.荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见p100片段.(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论:(1)p1OO cDNA全长成功载入pEGFP-C2质粒.(2)p100蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达.     

孤束核微注射5-羟色胺系统药物对大鼠睡眠-觉醒的影响及机制

目的:探讨孤束核(NST)微注射5-羟色胺(5-HT)系统药物对大鼠睡眠-觉醒的影响及其机制.方法:选用雄性SD大鼠,分7组,孤束核分别微注射5-羟基色氨酸(5-HTP)、非特异性5-HT受体阻断剂麦角新碱(MS)、5-羟色胺1A受体(5-HT1AR)激动剂8-OH-DPAT、5-HT1AR拮抗剂spiperone、cAMP、cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)拮抗剂H89和生理盐水(NS)后,采用光电脑电机记录脑电和肌电;采用免疫组化ABC法检测NST处5-HT1AR及5-HT表达情况.结果:与处理前相比,NS组和MS组大鼠睡眠-觉醒各期差异均无统计学意义,5-HTP组、8-OH-DPAT组和H89组给药后均显示觉醒期(W)缩短,异相睡眠(PS)延长(P<0.05或P<0.01),8-OH-DPAT组和H89组慢波睡眠(SWS)延长(P<0.01或P<0.05);spiperone组和cAMP组W延长(P<0.01或P<0.05),SWS缩短(P<0.01或P<0.05),spiperone组PS缩短(P<0.05).免疫组化结果显示,与NS组相比,5-HTP组的5-H T1AR阳性细胞数较多,5-HT能神经纤维末梢5-HT表达增强,MS组则结果相反.结论:作为睡眠诱发区,孤束核很可能是通过5一羟色胺作用于5-HT1AR,使cAMP生成减少,PKA磷酸化减少而发挥使觉醒减少、睡眠增加的生物学效应.     

针对人SND1基因两个AUG的细胞应激分析

【摘要】目的 针对人SND1基因2个蛋白翻译起始密码子AUG构建真核表达质粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/ 2,并分析2个AUG在SND1应激颗粒形成中的作用。方法 以SND1全长转录本为模板,PCR法扩增含BamHⅠ和 EcoRⅠ酶切位点的目的基因SND1-No1/2,双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pCMV-N-Flag,以T4-DNA连接酶将两者连接成pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重组质粒,然后将构建的重组质粒转染入HeLa细胞内,以Western印迹法检测Flag标签（DYKDDDDK）与SND1-No1/2的融合表达,最后以细胞免疫荧光实验检测在氧化应激状态下Flag SND1-No1/2融合蛋白与内源性SND1应激颗粒的胞内共定位情况。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,Western印迹结果检测到融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表达;细胞免疫荧光结果显示Flag-SND1-No1/2 均可与内源性SND1应激颗粒共定位。结论重组pCMV-N-Flag-SND1-No1/2质粒构建成功,SND1基因第1个 AUG的缺失并不影响SND1应激颗粒的形成。     

重组Pegfp-C2-PSF质粒的构建及表达

目的 将人类PSF基因定向连人pEGFP-C2质粒,使PSF蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究PSF蛋白的功能及定位奠定实验基础.方法 采用EcoRⅠ和SalⅠ双酶切方法,从pGEX-2TK-PSF质粒中获得PSF蛋白的cDNA全长;连入pEGFP-C2质粒的C端.将构建成功的pEGFP-C2-PSF质粒转染人HeLa 细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 ①将该质粒进行双酶切鉴定可见PSF片段;②转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.结论 ① PSF cDNA全长成功连入pEGFP-C2质粒;② PSF蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达.     

P100蛋白及其片段重组质粒构建与表达

目的 分别将人类p100基因,p100 的SN基因片段和TD片段定向连入pERFP-CI质粒,使它们可与红色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,从而为进一步研究P100蛋白及其片段的定位、功能及与其它蛋白的相互关系奠定实验基础.方法 PCR分别扩增出P100蛋白全长,SN片段和TD片段基因的序列,定向克隆至真核表达载体pERFP-CI, 构建相应的3种重组质粒.将构建成功的质粒转染入HeLa 细胞,荧光显微镜下可观察红色荧光融合蛋白表达.结果 ① PCR 法获得P100 基因序列, 长度为2 659 bp,SN基因片段1 918 bp,TD基因片段741 bp;②将重组质粒直接进行双酶切鉴定可见P100片段, 将经过蓝白斑筛选后的重组子经双酶切再与pERFP-CI载体连接并酶切得到SN片段和TD片段;③转染重组质粒后可观察到红色荧光蛋白的表达.结论 3种外源片段成功载入pERFP-CI质粒; P100全长、SN片段、TD片段均可与红色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达.     

重组pEGFP-hSnu114质粒的构建及表达

目的 将hSnu114基因定向连入pEGFP质粒GFP的下游,使hSnu114蛋白可与绿色荧光蛋白在真核细胞内融合表达.从而为进一步研究hSnu114蛋白的功能奠定实验基础.方法 本实验已经构建PTZ57R/T –hSnu114和pcDNA3.1(-)-hSnu114重组质粒,想要构建pEGFP-hSnu114重组质粒,需通过引入SalⅠ酶切位点,调整N端起始密码子与绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因之间的序列,使其不破坏读码框,融合蛋白正确表达.PCR扩增出hSnu114的第一部份 (SalⅠ～MunⅠ基因序列),从 hSnu114-pcDNA3.1(-)重组质粒回收hSnu114的第二部分(MunⅠ～BamHⅠ片段),定向克隆至T/A载体,构建hSnu114全长(SalⅠ～BamHⅠ)pTZ57R/T重组质粒.采用SalⅠ和BamHⅠ双酶切方法,从重组质粒中获得hSnu114全长,将该基因片段连接入pEGFP质粒.将构建成功的pEGFP-hSnu114质粒,转染入HeLa细胞,荧光显微镜下可观察绿色荧光蛋白表达.进行Western印迹检测.结果 ① hSnu114 SalⅠ～MunⅠ目的片段获取.②将该pEGFP-hSnu114质粒进行双酶切鉴定可见hSnu114全长片段.③转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达.④ Western印迹可检测到pEGFP-hSnu114融合蛋白.结论 ① hSnu114全长成功载入pEGFP质粒.② hSnu114蛋白可与绿色荧光蛋白在真核细胞中融合表达.     

多功能G3BP应激蛋白的红色及蓝色荧光标记

目的:分别构建含有樱桃红荧光蛋白和蓝色荧光蛋白(BFP)标签的应激蛋白G3BP表达质粒,实现活细胞内G3BP蛋白的红/蓝色荧光标记。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,分别利用EcoRI和BamHI双酶切法将目的片段连接到pmCheery-C1和pEBFP-N1载体上,再将构建成功的pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP重组质粒转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦显微镜及Western印迹法检测红/蓝色荧光蛋白与目的蛋白G3BP的融合表达以及在活细胞内的共定位情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到红/蓝色融合蛋白的表达,共定位分析结果显示两者均可在HeLa细胞胞浆中形成应激颗粒。结论:pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP构建成功,对G3BP蛋白的红/蓝色荧光标记有助于进行其在细胞应激方面的机制研究。     

GST-G3BP Domain 1～5原核表达质粒的构建及其表达

目的:构建GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒,并在大肠杆菌中稳定表达。方法:PCR扩增G3BP Domain1～5片段,利用限制性内切酶EcoRI和NotI将其连接至载体pGEX-4T-1,将连接产物转化大肠杆菌,挑取单菌落,提取质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序。将转化正确的大肠杆菌过夜培养,IPTG诱导融合蛋白表达,immobilized Glutathione beads钓取目的蛋白。结果:G3BP Domain1～5片段均成功连接至载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌BL21中可得到稳定表达的融合蛋白。结论:GST-G3BP Domain1～5的融合表达质粒构建成功。