转铁蛋白受体与磁共振分子影像学研究近况

分子生物学与医学影像学交叉而形成的分子影像学已成为医学研究的热点之一。磁共振分子成像是其中最有前途的技术．其成像的关键在于报告基因系统的选择应用。综述了以转铁蛋白受体为报告基因系统的磁共振成像研究近况。     

METH1在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的通过观察血管生成抑制因子METH1的cDNA片段在酵母双杂交中的表达及检测其对报告基因有无激活作用，为进一步明确METHI抑制增生性瘢痕的分子机制奠定基础。方法采用酵母双杂交Ga14系统3，经PCR扩增子METH1的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后。再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中。将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因的激活作用。结果成功获得METH1的cDNA片段，该片段所表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性，且对报告基因无激活作用。结论血管生成抑制因子METH1蛋白活性区在酵母双杂交系统中的表达产物。可作为诱饵蛋白进行相互作用蛋白的筛选研究。     

FasL启动子调控的报告基因表达质粒的构建及活性分析

目的扩增FasL启动子并构建带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒,并评价在皮质酮(啮齿类动物体内的糖皮质激素)作用的睾丸Leydig细胞中,由FasL启动子调控的荧光素酶的表达活性。本研究将为进一步分析Leydig细胞中FasL启动子转录调控的作用机制奠定基础。方法采用DNA重组技术构建由FasL启动子调控的荧光素酶报告基因的表达质粒。此重组质粒经阳离子脂质体LipofectAMINE介导,瞬时转染入Leydig细胞中,36h后细胞经皮质酮处理,并于48h时收集细胞。测定荧光素酶的相对表达活性。结果(1)酶切及测序证实成功扩增FasL基因启动子并构建了带有FasL基因启动子的报告基因表达质粒；(2)皮质酮处理的Leydig细胞中FasL启动子调控的荧光素酶表达质粒的表达活性显著增高。结论构建成功的带有FasL启动子的荧光素酶报告质粒可准确地评价FasL启动子在凋亡过程中的作用。     

真核表达载体Rc／LTR携带的报告基因可在Hela细胞中高效表达

利用基因重组技术构建了荧光酶报告基因ｌｕｃ和真表达载体Ｒｃ／ＬＴＲ的重组子Ｒｃ／ＬＴＲ－ｌｕｃ。将此重组子转染Ｈｅｌａ细胞后，ｌｕｃ基因在Ｈｅｌａ细胞中得到高效表达。蛋白激酶Ｃ激活剂ＴＰＡ可使ｌｕｃ基因的表达成增加。结果表明，ＨＩＶ－ＬＴＲ可用作真核细胞内外源基因表达的有效启动子。     

-突触核蛋白抑制酪氨酸羟化酶基因-495~+25区调节活性

α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)的生理功能尚不清楚,近年研究表明,α-SYN与帕金森病(Parkinson's disease,PD)的发生发展密切相关[1].最近的研究显示,在α-SYN过表达的细胞系,酪氨酸羟化酶(ty6rosine hydroxylase,TH)的表达显著减少[2],提示α-SYN的功能与多巴胺代谢密切相关.     

人类β—珠蛋白基因5’—1559bp上游转录调控区的重组及表达

目的 探寻人类β－珠蛋白基因5′－帽位上游新转录调控元件。方法：利用重组DNA技术,构建及克隆3人含有人类β－基因不同5‘－帽位上游片段的荧光素酶报告基因重组载体（pGL2-promoter/SB-β^RHB734、pGL2-promoter/SB-β^R AB573、pGL2-promoter/SB-β^RHfB263）,分别将其导入Hela细胞中,采用β-半乳糖苷酶报告β-半乳糖苷酶报告基因为转移效率内对照,空白的荧光素酶基因载体为基础对照,进行荧光素酶活性比较。结果 3个基因片段载体构建符合设计,其相对抑制活性分别为59．74％、80．97％、79．42％。结论 初步提示人类β－基因5‘帽位上游－2132～－1822bp片段及－1822～15559bp片段内可能存在起负调控作用的顺式作用元件（抑制子）,而－2277bp～-2132bp片段间未检出报制子或增强子活性存在。 此初步结果尚需进一步研究证实和阐明其结构与功能的关系。     

基于雌激素应答元件转录调节的药物筛选模型的建立

目的 :建立靶向雌激素应答元件 (ERE)的药物筛选模型 ,为筛选雌激素受体 (ER)配体奠定基础。方法 :构建重组报告基因载体 pERE-TAL-SEAP ,与对照载体 pCMVβ瞬时共转染表达人ERα或ERβ的Hela细胞株 ,观察化合物对SEAP报告基因表达活性的影响。结果 :雌二醇 (E₂ )诱导表达人ERα或ERβ的Hela细胞株SEAP的表达 ,EC₅₀分别为 (80.5 8± 8.51) pmol·L^-1和 (10 3.90± 5.29) pmol·L^-1,最大效应浓度为 10nmol·L^-1;金雀黄素 (Gen)也诱导表达人ERα和ERβHela细胞株SEAP的表达 ,EC₅₀ 分别为 (39.38±2.26)nmol·L^-1和 (10.86±0 .75 )nmol·L^-1;最大效应浓度为 1μmol·L^-1;E₂ 和Gen诱导SEAP表达的最大水平较对照孔细胞高 7～ 14倍。ER拮抗剂ICI182 ,780可完全抑制E₂ 和Gen对SEAP的诱导作用。结论 :利用此模型检测化合物诱导报告基因的表达水平可筛选和发现ER配体。     

毒蕈胆碱M_1受体激动剂的高通量筛选模型

目的　建立毒蕈碱样胆碱M1 受体激动剂的高通量筛选模型 ,以此模型进行M1 受体激动剂筛选。方法　将M1 受体基因质粒 (M1 /pCDNA3 1 )与报告基因质粒 (3×CRE/ 3×MRE/SRE LUC)按 1∶5的比例共转染HEK2 93 ,建立了一个稳定的M1 受体激动剂报告基因筛选细胞株。配体与细胞表面M1 受体结合后 ,激活相应的信号通路 ,调节报告基因的表达 ,通过测定荧光酶素报告基因表达水平的变化 ,评估配体激活M1 受体的生物活性。结果　通过对筛选条件 ,如细胞数目、荧光素酶表达时间、底物浓度的优化 ,建立了可靠的筛选方法 ,并对多种抗衰老中药水提物进行了筛选 ,找到 3种对M1 受体有活性的中药。结论　该系统能准确、稳定、有效地应用于M1 受体激动剂的高通量筛选     

染料木黄酮、拟雌内酯及槲皮素对孕烷X受体介导的CYP3A4转录的调节作用

目的　研究植物雌激素中的染料木黄酮(GST)、拟雌内酯 (COM)及槲皮素 (QU)能否通过活化人孕烷X受体 (PXR)诱导CYP3A4的转录表达。方法用PXR依赖的瞬时转染报告基因试验检测 3种植物雌激素的诱导作用。结果　GST ,COM和QU均能通过活化PXR诱导HepG2 细胞CYP3A4基因的转录表达 ,最大诱导倍数 (相对于用浓度为 0 .1%的DMSO处理的细胞 )在本实验中分别为 11.97(P <0 .0 1) ,2 .98(P <0 .0 1)和 3.2 8(P <0 .0 1)。结论　GST ,COM和QU均能诱导CYP3A4的转录表达 ,其作用机制通过活化PXR。GST ,COM和QU的摄入可能影响其他CYP3A4底物尤其是药物在体内的代谢。     

基于GADD153启动子的环境致癌物快速筛选系统研究

[目的]构建快速检测环境中痕量致癌物DNA损伤效应的重组人肝细胞株。[方法]构建含生长抑制与DNA损伤基因153(GADD153)启动子和萤光素酶报告基因的重组稳定转染人肝肿瘤HepG2细胞;发光检测不同致癌物对稳定转染细胞的DNA损伤效应;同时RT-PCR检测内源性GADD153mRNA的表达;彗星试验(Cometassay)检测DNA的损伤效应。[结果]稳定转染GADD153-LUC细胞株可检出多环芳烃、芳香胺、重金属、农药等已知环境致癌物以及实际水样中的含量。检测结果与彗星试验结果相比,大多数检测下限均低于彗星试验的检测限,其中对苯并芘、氯化镉和2-氨基芴的检测灵敏度分别高于彗星试验1000、300和100倍;对Aems试验不敏感的重金属、四氯化碳、氟化钠等重组细胞株具有较高的检测灵敏性。10μmol/L的氯化镉可诱导内源性GADD153mRNA和萤光素酶活性表达增加,相关分析表明两者具有良好的相关性(r2=0.9539)。[结论]重组细胞株GADD153-LUC细胞可快速检测环境中痕量污染物的DNA损伤效应。