α-突触核蛋白对MES23．5多巴胺能神经细胞的促增殖作用

目的：分析外源性野生型α-突触核蛋白对多巴胺能神经细胞增殖的影响及其分子机制。 方法：实验于2005—04／11在北京老年病研究所神经生物室完成。向MES23．5多巴胺能神经细胞的培养基中加入重组人野生型α-突触核蛋白，孵育48h后用细胞免疫荧光标记法和Western blot分析法检测α-突触核蛋白在细胞内的分布，用MTS法绘制生长曲线观察细胞增殖率，用基因芯片分技术观察α-突触核蛋白处理细胞的基因表达谱变化。 结果：重组人野生型α-突触核蛋白可以进入MES23．5多巴胺能神经细胞，并促进其增殖。在α-突触核蛋白处理的细胞。有22个基因的表达发生明显变化，有3个基因与内吞相关，5个与转录有关，3个与蛋白质合成有关，3个与细胞生长和增殖有关，4个与分化有关，1个与增殖及分化均有关，2个与小泡生成和神经递质释放有关，1个与生理周期有关。 结论：外源性α-突触核蛋白可能通过内吞作用进入MES23．5多巴胺能神经细胞。从而促进其增殖；α-突触核蛋白的促细胞增殖作用可能与其影响某些基因表达有关。     

人早老素15’端390碱基片段的真核表达载体的构建与鉴定

目的：构建表达人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒。 方法：实验于2004-12／2005一01在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。参照人早老素1mRNA结构设计合成含适当酶切位点的聚合酶链反应引物，从质粒pBS—Presenilins1扩增其5’端390bp的cDNA片段，插人质粒pGEX-4T-1，转化人大肠杆菌BL21（DE3），以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷诱导表达，使其在大肠杆菌中表达以谷胱甘肽S转移酶为标签的融合蛋白质。用凝血酶定点分解融合蛋白，并应用亲和层析法纯化早老素1N130肽。 结果：聚合酶链反应扩增产物约400bp，核酸序列分析结果显示，扩增产物为393bp编码130个氨基酸。重组质粒在原核细胞中表达受异丙基-B—D-硫代半乳糖苷诱导呈时间依赖性递增。纯化的目的蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带，其表观相对分子质量为13000。每升菌液可收获目的蛋白4．5mg。 结论：构建人早老素1N端部分肽段的基因重组质粒，制备了基因重组型早老素1N130肽，并确认其亲水特征。     

揭示α-突触核蛋白与帕金森病的关系：α-突触核蛋白单克隆抗体的研究

目的：α-突触核蛋白(α-Synuclein，α-Syn)是与帕金森病的发病密切相关的蛋白质。关于这种蛋白质在脑内神经元的亚细胞分布迄今尚无定论。制备α-Syn抗体探讨α-Syn在亚细胞的定位。方法：实验于2004—01／05在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。采用重组的人α-Syn免疫小鼠，并将其脾细胞与骨髓瘤融合制备出杂交瘤，利用免疫组化和Western blot法筛选阳性克隆，获得一特异性抗α-Syn单克隆抗体。结果：噬菌体多肽展示分析表明，该抗体识别人α-Syn C-末端的一段特异序列，但该序列与大鼠和小鼠的相应序列差一个氨基酸。免疫印记分析表明，该抗体能够检测人、大鼠与小鼠脑组织中的α-Syn。用该抗体进行免疫组化染色结果显示，α-Syn免疫阳性物质主要存在于神经元末梢与核中。结论：所制备的单克隆抗体对α-Syn具有特异性，可用于人、大鼠和小鼠的α-Syn研究。     

大鼠脑神经元和胶质细胞中葡萄糖转运体表达和定位的免疫组织化学证据

目的:探讨Mr45000葡萄糖运输体1在脑实质细胞中的分布。方法:实验于2004-08/09在首都医科大学宣武医院低氧医学研究所神经生物研究实验室完成。选择SD成年二级大鼠2只,雄性,体质量约250g。1只大鼠脑制成匀浆后,验证葡萄糖运输体1C-末端的部分合成肽免疫家兔制成的抗血清对Mr45000葡萄糖运输体1的特异性应用免疫印迹试验。另1只雄性大鼠在深麻醉下,取脑制成20μm切片,观察Mr45000葡萄糖运输体1在大鼠脑实质细胞中的定位应用抗生素蛋白—生物素复合体染色法和免疫电镜法。结果:①葡萄糖运输体1C-末端的部分合成肽免疫家兔制成的抗血清是一种高效价的对Mr45000葡萄糖运输体1特异的抗体。②Mr45000葡萄糖运输体1蛋白在正常脑的胶质细胞以及皮质以外某些特定部位的神经元中表达。③Mr45000葡萄糖运输体1阳性胶质细胞多数是少突胶质细胞,少数是星形胶质细胞。结论:在适当延长抗体和脑组织切片反应时间的基础上,Mr45000葡萄糖运输体1在星形胶质细胞、少突胶质细胞和某些特定部位的神经元中均有表达。     

低氧预适应上调大鼠海马神经元和星形胶质细胞在急性缺氧时的葡萄糖转运蛋白的活性和基因表达

目的 研究低氧预适应对海马神经元和星形胶质细胞在急性缺氧暴露时的葡萄糖转运蛋白的活性和基因表达的影响。方法 培养大鼠海马神经元和星形胶质细胞,每天间歇暴露于低氧混合气体（1% O2、10% CO2、89% N2）20min,连续6d。最后1次低氧暴露24h后,将细胞暴露于无氧混合气体（10% CO2、90% N2）6h,然后立即检测[3H]-2-脱氧葡萄糖（2-DG）的摄取率、GLUT1和GLUT3的mRNA水平及神经元的存活率。结果 低氧预适应上调急性缺氧时神经元和星形胶质细胞的2-DG吸收率、星形胶质细胞GLUT1 mRNA的表达及神经元GLUT1和GLUT3 mRNA的表达,提高神经元存活率,这一作用可被细胞松弛素B消除。结论 低氧预适应上调海马神经元和星形胶质细胞在急性缺氧时的葡萄糖摄取率和葡萄糖转运蛋白的基因表达。     

14-3-3ζ蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

为了探讨14-3-3ζ蛋白在中枢神经系统内的分布,本文采用纯化的基因重组型14-3-3ζ蛋白免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗14-3-3ζ蛋白单克隆抗体;Western blot及免疫组织化学法鉴定抗体。结果显示:制备的单克隆抗体能特异性识别基因重组14-3-3ζ蛋白和大鼠脑匀浆32kD蛋白。免疫组化染色结果显示,14-3-3ζ蛋白在大鼠中枢神经系统广泛分布,在皮层、海马、杏仁核和基底前脑的免疫阳性染色较强,免疫阳性产物位于神经元胞浆内。本研究结果提示,14-3-3ζ蛋白可能具有多样化的生理功能。     

α-突触核蛋白促进原代神经元及转基因小鼠神经细胞表面NMDA受体的内在化

目的在原代培养神经元及转基因动物水平上,研究α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）对神经细胞表面N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体的影响及其机制。方法免疫荧光标记法和Western blotting测定NMDA受体（NMDA receptor,NMDAR）和Rab5B质量分数。Rab5B反义寡核苷酸抑制Rab5B基因表达。以原代培养神经细胞及转基因小鼠为模型,观察α-Syn蛋白增多对细胞膜NMDAR质量分数的影响以及Rab5B的作用。结果在细胞及动物水平,α-Syn明显上调Rab5B表达,促进NMDAR的内在化。而抑制Rab5B表达可消除α-Syn致NMDAR的内在化。结论α-Syn通过上调Rab5B的表达促进NMDAR的内在化。     

过氧化氢和帕金森病患者血清促进α-突触核蛋白向线粒体与细胞核转运

目的研究氧化应激和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者血清对α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)向线粒体以及细胞核转运的影响。方法将MES23.5多巴胺能神经细胞在含5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养,然后分别用过氧化氢(H2O2)以及PD和正常人血清处理,免疫荧光标记法观察不同处理对α-Syn向线粒体以及细胞核的转运以及对线粒体及细胞核的影响。比色法测定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、脂质氧化(malondialdehyde,MDA)和总抗氧化能力(totalanti-oxidation competence,T-AOC),观察血清的氧化应激水平。结果 H2O2和PD血清促进α-Syn向线粒体转运与细胞核转运,并造成线粒体皱缩、崩解,PD血清处理同时引起类似凋亡的核碎裂现象。PD血清的SOD、MDA和T-AOC高于对照血清。结论氧化应激和PD血清均可促进α-Syn向线粒体与细胞核转运,PD血清促进α-Syn向线粒体与细胞核转运可能与其氧化应激水平增高有关。     

缺血性卒中患者血浆磷酸化α-突触核蛋白水平及磷酸化形成比例的改变

目的分析缺血性卒中患者血浆磷酸化α-突触核蛋白(α-Syn)水平以及α-Syn磷酸化形成比例的改变。方法回顾性分析2013年5—9月武警后勤学院附属医院神经内科急性缺血性卒中住院患者45的临床资料,另收集同期年龄和性别相匹配的45名健康者为对照组。利用双抗体夹心的酶联免疫吸附(ELISA)法测定血浆中的磷酸化α-Syn水平。另将基因重组α-Syn加入血浆,计算磷酸化α-Syn占总α-Syn的比例。结果缺血性卒中患者血浆磷酸化α-Syn水平明显高于对照组[(0.0472±0.0042)μmol/L比(0.0312±0.0043)μmol/L];缺血性卒中患者血浆α-Syn磷酸化形成比例高于对照组[(0.1170±0.0176)μmol/(100μmol·h)比(0.0364±0.0098)μmol/(100μmol·h)]。受试者工作特征(ROC)曲线分析结果显示,血浆磷酸化α-Syn水平变化判定缺血卒中的特异度和敏感度分别为0.88和0.81,曲线下面积(AUC)为0.91,cut-off值为0.060 mol/L,AUC 95%CI:0.889~0.961;血浆α-Syn磷酸化形成比例改变判定缺血卒中的特异度和敏感度分别为0.84和0.81,AUC为0.90,cut-off值为0.055mol/L,AUC 95%CI:0.898~0.971。结论缺血性卒中患者血浆磷酸化α-Syn水平和血浆α-Syn磷酸化形成比例较健康者增高。     

一种检测帕金森患者血浆促进α-突触核蛋白寡聚体形成能力的方法

目的 建立一种检测帕金森病（Parkinson＇s disease,PD）患者血浆促进外源性α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）寡聚体形成的方法.方法 利用本室自制的鼠抗人α-Syn单克隆抗体建立检测α-Syn寡聚体的酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent,ELISA）方法.将不同质量浓度（200、100、50、25、12.5 μmol/L）重组人α-Syn在正常人和PD患者血浆中分别振荡孵育（37 ℃、280 r/min）24、48、72、96 h.用所建立的ELISA法检测振荡后血浆中的α-Syn寡聚体含量.结果 所建立ELISA方法可以特异性检测α-Syn寡聚体,不识别α-Syn单体.重组人α-Syn在质量浓度为100 μmol/L、血浆稀释3倍以下、振荡孵育48 h条件下可以在PD患者血浆中形成较多的寡聚体,并与对照血浆中形成的α-Syn寡聚体含量对比差异最大.结论 成功建立了一种检测PD患者血浆促进α-Syn寡聚体形成能力的方法,该方法可以用于诊断PD患者血浆的潜在病理变化.