原核细胞阳性克隆的筛选

基因重组的连接反应物通过转化产生大量转化菌 ,只有通过高敏感和高特异的筛选方法才能挑选和鉴定出含有正确目的基因的重组体。此类方法的基本原理基于 :① 196 7年 ,Ullmann等发现大肠杆菌带有完整的近操纵基因区段 β D半乳糖甘酶阴性的突变体和LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体之间互补 ,实现对 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D半乳糖(X gal)分解显色形成蓝色菌落 ;② 1975年 ,Grun stein和Hogness介绍一种在硝酸纤维素膜上原位裂解细菌菌落并释放DNA非共价结合于滤膜的方法 ,结合于滤膜的DNA可与相应的放射性标记的核酸探针进行杂…     

肺癌患者血清IL-6、IL-8和IL-10检测及临床意义

目的探讨血清白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)及白细胞介素10(IL-10)在肺癌免疫、发生、进展、转移和预后中的作用及其临床意义.方法选取TNMⅡ～Ⅳ期的肺癌患者共47例作为研究对象,其中23例患者进行了以铂类药为主的化疗,在治疗前及治疗后一月应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定其血清IL-6、IL-8及IL-10水平.另对7例死亡患者于临终前检测血清IL-6、IL-8及IL-10水平.同时取30例健康成人作为对照组.结果 47例肺癌患者不同病理类型之组间比较血清三组细胞因子水平无差异,但均明显高于正常对照组.三组间比较P<0.001;肺癌患者血清IL-6、IL-8及IL-10水平随着临床分期的进展而升高,有远处转移的晚期患者的血清IL-6、IL-8和IL-10明显高于无转移的早期患者;16例化疗有效,病情稳定和缓解的患者血清IL-6、IL-8及IL-10水平较化疗前明显下降;7例化疗无效、病情进展者血清IL-8、IL-10测无明显下降,IL-6进一步升高;7例死亡患者临终前血清IL-8水平有持续升高的趋势.结论 IL-6、IL-8和IL-10在肺癌的发生和进展中具有重要作用.血清IL-6、IL-8和IL-10联合检测对肺癌诊断有一定的参考价值,可作为辅助诊断和疗效观察的指标.     

质粒的制备

随着人类基因组计划的顺利进行 ,一个更为广阔且具活力和应用前景的研究领域人类基因组后计划已形成 ,并吸引全世界顶尖科学家和实验室参与。人类基因组后计划的研究内容主要涉及功能基因的分离、鉴定 ,其编码蛋白质的生物学功能及其可应用研究。本领域所采用的研究方法主要包括分子生物学、蛋白质组学和功能蛋白质学等实验方法。其中 ,分子生物学常用实验方法在研究中使用最广 ,可变性最大 ,且可选择最多。为提高我校广大科学研究者对分子生物学技术和实验方法有一较全面的了解和知晓本校可用的资源 ,特邀请本校分子生物学中心试验室根据其研究工作撰写有关分子生物学常用实验方法的介绍 ,并陆续在本刊上发表 ,供大家参考     

VitE对动脉粥样硬化模型兔肝脏肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响

目的　探讨维生素E(VitE)对动脉粥样硬化模型兔肝脏MLCK活性及表达的影响。方法　复制兔动脉粥样硬化模型 ,用γ 3 2 P参入法检测肝脏MLCK活性 ,免疫荧光法检测肝组织MLCK的表达。结果　动脉粥样硬化兔模型建立成功 ,在喂胆固醇 4wk及 12wk的动物组 ,肝脏MLCK活性[分别为 (1884 8 7± 74 34 3)、(18818 3± 346 9 9)cpm·mg-1protein]与正常对照比较 [(6 6 77 5± 10 9 6 0 )cpm·mg-1pro tein]升高 (P <0 0 5 ) ;但在喂胆固醇同时添加VitE后 ,肝脏MLCK活性 [(10 898 8± 2 0 4 1 2 )cpm·mg-1protein]与正常对照组比较升高不明显 (P >0 0 5 )。荧光显微镜下观察显示 ,兔肝在喂食胆固醇膳食 4wk后MLCK的表达有所增强 ,12wk后显著增强 ,12wk组的膳食中同时加VitE后 ,MLCK表达有所下降。结论　在动脉粥样硬化过程中 ,肝脏病变可能与MLCK活性增强有关 ,VitE可能是降低肝脏MLCK活性的因素 ,同时防止肝细胞的损伤     

胰岛素对糖尿病模型大鼠肾脏肌球蛋白轻链激酶表达的影响

已知糖尿病早期肾小球滤过率(GFR)升高,并与糖尿病肾病的发展有关[1,2].肾小动脉血管平滑肌的收缩改变了肾血流动力学是引起GFR升高的原因之一.探索糖尿病肾血管平滑肌收缩的调控因素可为进一步阐明糖尿病发生发展机制打下良好的基础.肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达增加和活性升高是血管平滑肌收缩的启动因素之一[3].糖尿病个体是否存在MLCK表达的变化尚未见报道.本研究在复制大鼠糖尿病模型的基础上,观察胰岛素对糖尿病大鼠肾MLCK表达的影响.     

肺癌患者血清肿瘤标记物检测的临床意义及预后评估

目的评估血清癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)和特异性烯醇化酶(NSE)水平在肺癌诊断中的价值,探讨三项肿瘤标记物血清水平与患者临床特征、化疗疗效和预后的关系。方法采用化学发光法检测227例肺癌患者和60例肺良性疾病患者血清中CEA、CYFRA21-1、NSE含量,同时收集患者完整的临床资料,随访患者无进展生存时间(PFS),使用SPSS17.0软件对所得数据进行统计分析。结果 1肺癌组血清CEA、CYFRA21-1、NSE水平明显高于肺良性疾病组(P0.01);CEA、CYFRA21-1、NSE的ROC曲线下面积分别是0.8、0.6、0.8,均大于0.5。腺癌、鳞癌、小细胞肺癌分别以CEA、CYFRA21-1、NSE检测灵敏度最高(P0.01)。三项肿瘤标记物联合检测较单项检测诊断灵敏度显著提高。2与I+II期患者比较,IV期肺癌患者CEA、CYFRA21-1、NSE水平明显升高(P0.05);胸外转移组三项肿瘤标记物均显著高于无转移组(P0.05)。3疾病进展(PD)组患者的治疗前血清CYFRA21-1、NSE水平明显高于疾病控制(DC)组(P0.05)。4治疗前血清CYFRA21-1、NSE水平正常的患者PFS明显长于升高者(P0.05)。结论血清CEA、CYFRA21-1和NSE检测有助于肺癌的诊断,联合检测更优,且对鉴别肺癌与肺部良性疾病、有无转移的评价及肺癌不同病理类型和分期有一定的参考价值;同时,治疗前CYFRA21-1和NSE血清水平可以评估肺癌的预后,观察治疗效果。     

褪黑素通过 ERK/MAPK 通路调控 AS 兔动脉内皮细胞 MLCK 表达

 目的 探讨褪黑素（ melatonin ， MLT ）是否可通过信号调节激酶 / 丝裂原活化蛋白激酶（ ERK/MAPK ）通路调控动脉粥样硬化（ atherosclerosis ， AS ）模型兔动脉内皮细胞肌球蛋白轻链激酶（ myosin light chain kinase ， MLCK ）的表达。 方法 复制兔 AS 模型，分析血清中相关脂质成分的动态变化；γ -³²P-ATP 掺入法测定模型兔主动脉的 MLCK 活性；动脉经冰冻切片，免疫组化检测动脉内膜 MLCK 的表达，伊红（ HE ）染色观察动脉壁的形态结构； Western blot 检测 AS 兔动脉组织 MLCK 的表达和 ERK 磷酸化水平。 结果 AS 兔模型复制成功，实验兔在高胆固醇（ cholesterol ， Cho ）饮食 4 ， 8 ， 12 周后，与正常对照相比，血清中相关生化指标有逐渐增加趋势（ <> P <0.05 ）；γ -³²P-ATP 掺入法显示动脉组织中 MLCK 的活性呈逐渐增强趋势（ <> P <0.05 ）， Western blot 和免疫组化则显示动脉内皮细胞 MLCK 的表达、 ERK 磷酸化水平亦呈逐渐增强趋势， HE 染色显示主动脉内膜逐渐增厚，细胞间隙逐渐增大；而加喂 MLT 后，动脉组织 MLCK 的表达、 ERK 磷酸化水平及 MLCK 的活性和主动脉内膜通透性均有所下降，而泡沫细胞形成量逐渐增多，至高 Cho 饮食 12 周时则形成了明显的 AS 斑块，加喂 MLT 后，主动脉内膜病变则有一定程度减轻。 结论 MLT 可能通过 ERK/MAPK 通路下调模型兔动脉内皮细胞 MLCK 活性而减轻 AS 斑块的病变程度。     

人非肌肉肌球蛋白轻链激酶N端表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建人非肌肉肌球蛋白轻链激酶(hnmMLCK)N端表达载体及其体外表达与表达产物的纯化。方法：用PCR方法扩增hnmMLCK的N端cDNA ,插入质粒pBKcmv中的构建成表达载体，转化入大肠杆菌XL1-blue，经IPTG诱导表达，表达产物用电洗脱的方法初步纯化。结果：经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为hnmMLCK重组质粒，SDS－PAGE证实获得分子量为21ku的融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的21％。结论：成功构建了重组hnmMLCK表达载体，并在大肠杆菌中获得表达，为进一步研究及临床应用奠定了良好基础。     

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对肝癌细胞株HepG2增殖凋亡分化的影响

目的 研究新合成的全反式维甲酸(ATRA)衍生物(4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯)对人肝癌细胞株HepG2体外增殖、凋亡及分化情况的影响.方法 3种浓度(1、5、10 μmol/L)的ATRA衍生物分别处理HepG2细胞,1、2、3、7d后用MTT法检测4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对HepG2细胞增殖的影响;酶动力学法检测γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)比活性和甲胎蛋白(AFP)分泌量变化;流式细胞术分析细胞周期及凋亡情况;Western blot检测HepG2细胞中凋亡相关蛋白的表达量.结果 10 μmol/L的4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯可明显诱导HepG2细胞凋亡,凋亡率达到49%,并且使代表肝细胞恶变的γ-GT比活性、AFP分泌量明显下降,Western blot显示4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯显著抑制Bcl-2、Bcl-xS/L和p-Erk表达.结论 4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯是肝癌细胞HepG2有效的分化诱导剂,并明显促进肝癌细胞凋亡.     

全反式维甲酸及其衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对A549细胞增殖和OPN表达的影响

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)及其新型衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(ATPR)对人肺腺癌细胞株A549增殖和骨桥蛋白(OPN)表达的影响及其相关性.方法 以A549细胞株为研究对象,分别予以不同浓度的ATRA及ATPR进行干预,应用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法测定A549细胞的增殖情况;Western...