b型流感嗜血杆菌D蛋白原核可溶性表达研究

目的 通过原核表达系统可溶性表达重组D蛋白,为多糖结合疫苗的制备提供蛋白载体.方法 将Hib CMCC株基因组DNA中去除信号肽的hpd基因片段插入pET43.1a表达质粒,转化入感受态大肠埃希菌BL21 (DE3),IPTG诱导表达.表达的重组蛋白,经过硫酸铵沉淀和DEAE阴离子交换柱层析纯化后,用Western Blot的方法鉴定其免疫反应原性.结果 表达的重组蛋白以可溶性形式存在,表达量约占菌株总蛋白的44％,经过初步纯化后的重组蛋白可以和Hib抗血清发生特异性反应.结论 成功构建了D蛋白重组表达质粒,并在原核细胞中以可溶性形式表达出具有良好免疫反应原性的D蛋白.     

甲型肝炎病毒3Cpro蛋白的研究进展

甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus,简称HAV）是甲型病毒性肝炎的病原学致病因子[1],属小核糖核酸病毒科嗜肝病毒属,无包膜,直径27～32 nm,形态发生上与其他的小核糖核酸病毒无异,为二十面体立体对称结构.     

诊断用丁肝抗原的基因优化及其蛋白表达、纯化和鉴定

目的 获取有生物活性的丁肝抗原蛋白,探讨其作为诊断试剂的应用价值.方法 经密码子优化,合成人工编码的丁肝抗原基因序列;以M48作为表达载体,构建带有硫氧还蛋白的重组表达质粒;在大肠埃希氏菌中经IPTG诱导表达;以亲和层析纯化并以ELISA鉴定该蛋白.结果 酶切鉴定构建的质粒正确;SDS-PAGE结果显示表达和纯化的外源蛋白与预期相对分子质量大小一致;ELISA鉴定该蛋白有与丁肝抗体特异性结合的活性.结论 成功获得有生物活性的可供诊断用的丁肝抗原蛋白,为丁肝诊断试剂的研发奠定了基础.     

甲型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的比较

目的 比较本实验室内部建立的甲型肝炎病毒核酸定量体系和另外两个商品化实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测效果.方法 本实验室内部建立的HAV核酸检测系统选取HAV基因组的高保守区段5 ′非编码区作为扩增靶点,定量标准品采用体外转录获得的RNA分子,HAV疫苗株储存液倍比稀释成10-8 ～ 10-1后提取RNA作为模板用以比较该反应体系与市售商品化试剂盒的准确性、灵敏度以及特异性.结果 本实验室内部建立的HAV核酸检测体系十分适宜于HAV的检测,最低检测极限达到10 TCID50/ml,比国内某厂商生产的HAV定量PCR检测试剂要灵敏,然而Qiagen公司的RealArt HAV LC RT-PCR检测试剂效果最好,其检测极限可以达到5 TCID50/ml.结论 本实验室内部建立的HAV核酸定量体系可重复性好,敏感度高,特异性强,在临床样本,环境样本以及食品样本的检测方面具有广阔的应用前景.     

我国2015-2017年急性乙型肝炎病例HBV基因型分布特征分析

目的分析我国急性乙型肝炎(乙肝)病例HBV基因型流行病学分布特征。方法收集2015-2017年中国疾病预防控制信息系统报告的急性乙肝病例620例, 通过巢式PCR扩增获得全长HBV基因组, 构建系统发育树确定HBV基因型, 结合基础资料分析HBV基因型的分布情况。结果在620例急性乙肝病例中, 成功分型519例(83.71%, 519/620), 包括A型(0.19%, 1/519)、B型(27.17%, 141/519)、C型(62.04%, 322/519)、D型(9.06%, 47/519)、I型(0.77%, 4/519)和CD重组型(0.77%, 4/519);2个主要的基因亚型为B2(95.03%, 134/141)和C2(72.67%, 234/322)。基因型在我国7个地区分布不同, C型在东北(94.55%, 52/55)、华北(93.85%, 61/65)、华东(78.87%, 56/71)和华南地区(58.14%, 50/86)的比例较高, B型在华中(58.07%, 36/62)和西南(52.94%, 45/85)地区的比例较高, 西北地区的D型(48.42%,...     

基因优化对基因工程丁型肝炎小抗原蛋白表达和纯化的影响

目的 探讨基因优化对基因工程丁型肝炎(丁肝)小抗原蛋白表达和纯化的影响.方法 依据GenBank上的丁肝小抗原原始基因,参照大肠埃希菌优势密码子谱进行优化;再分别将优化前后的两组基因进行常规原核表达,用SDS-PAGE电泳比较目的蛋白表达量及优势表达方式;进一步以柱层析进行纯化,再以Image Lab软件分析SDS-PAGE电泳条带,比较两组目的蛋白的纯度.结果 SDS-PAGE显示,两组表达的目的蛋白均与预期相对分子质量大小一致,优化基因组的蛋白表达量高于原始基因组,且更倾向于可溶性表达;经柱层析纯化后,前者的目的蛋白纯度也明显高于后者,可达96.3％.结论 基因优化可提高基因工程丁肝小抗原蛋白表达量,增加可溶性蛋白的比例;且表达产物更易纯化至较高纯度以供诊断使用.     

基因工程丁肝抗原的获取和鉴定

目的获取有生物活性的基因工程丁肝抗原蛋白,探讨其作为诊断试剂的应用价值。方法合成人工编码的丁肝小抗原基因;以M48为载体,构建重组表达质粒;进行原核表达;以亲和层析纯化并以Western blotting和ELISA鉴定该蛋白。结果酶切鉴定构建的表达质粒正确;SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白与预期分子质量大小一致;Western blotting和ELISA结果显示该蛋白能与丁肝抗体特异性结合。结论成功获取了有生物活性的基因工程丁肝抗原蛋白,可以1∶1000稀释度作为包被抗原替代丁肝抗体诊断试剂成分,用于ELISA检测。     

一种改良的环介导恒温扩增技术在甲型肝炎病毒核酸检测上的应用

目的 建立一种更加快速简便的环介导恒温扩增技术(LAMP)检测甲型肝炎病毒(HAV).方法 本研究通过在传统LAMP的基础上加入加速引物建立了一种改进型的LAMP体系.结果 精确性和可重复性实验证实改进后的HAV LAMP检测体系稳定可靠,重复性强,并且较传统的LAMP灵敏度更高,检测极限可以达到5 TCID50/ml.当该方法用于甲型肝炎患者急性期血清临床样本的检测时,实验结果与TaqMan实时荧光定量PCR的检测结果一致.结论 改进型的LAMP技术有望应用于HAV临床样本检测,同时也适用于HAV流行地区的病原学监测和调查.     

慢性乙型肝炎感染自然史

依据病毒学和生物化学参数,可将慢性乙肝自然史划分为免疫耐受期(Ⅰ期)、免疫清除期(Ⅱ期)以及免疫无活性乙肝病毒非复制期(Ⅲ期).有时患者会进入一个乙肝e抗原(HBeAg)血症消失而病毒血症出现以及慢性活动性肝炎发展的时期,即HBeAg阴性的HBV复制期(Ⅳ期),表征着前核心区(pre-core)突变株的出现[1].四个时期并不是必须全部出现在某一患者身上,也不是必须按顺序出现.