诊断用丁肝抗原的基因优化及其蛋白表达、纯化和鉴定

目的 获取有生物活性的丁肝抗原蛋白,探讨其作为诊断试剂的应用价值.方法 经密码子优化,合成人工编码的丁肝抗原基因序列;以M48作为表达载体,构建带有硫氧还蛋白的重组表达质粒;在大肠埃希氏菌中经IPTG诱导表达;以亲和层析纯化并以ELISA鉴定该蛋白.结果 酶切鉴定构建的质粒正确;SDS-PAGE结果显示表达和纯化的外源蛋白与预期相对分子质量大小一致;ELISA鉴定该蛋白有与丁肝抗体特异性结合的活性.结论 成功获得有生物活性的可供诊断用的丁肝抗原蛋白,为丁肝诊断试剂的研发奠定了基础.     

牛黄清感胶囊溶液体外抑制新型冠状病毒活性效果分析

目的:研究中药制剂牛黄清感胶囊对新型冠状病毒的抑制作用,可为药物筛选和新冠肺炎治疗提供实验依据。方法:用Vero-E6细胞分离和培养新型冠状病毒GS048株,制备的牛黄清感胶囊溶液体外与新冠病毒共孵育后测定病毒滴度改变;将含有药物的培养液作用于新型冠状病毒接种的细胞,测定牛黄清感胶囊溶液在细胞培养中对新型冠状病毒增殖的...     

基因工程丁肝抗原的获取和鉴定

目的获取有生物活性的基因工程丁肝抗原蛋白,探讨其作为诊断试剂的应用价值。方法合成人工编码的丁肝小抗原基因;以M48为载体,构建重组表达质粒;进行原核表达;以亲和层析纯化并以Western blotting和ELISA鉴定该蛋白。结果酶切鉴定构建的表达质粒正确;SDS-PAGE电泳结果显示该蛋白与预期分子质量大小一致;Western blotting和ELISA结果显示该蛋白能与丁肝抗体特异性结合。结论成功获取了有生物活性的基因工程丁肝抗原蛋白,可以1∶1000稀释度作为包被抗原替代丁肝抗体诊断试剂成分,用于ELISA检测。     

丁型肝炎的分子生物学特征及研究进展

HDV是已知的最小动物病毒,具有很多独特的生物学特征.了解其生物学特性是进行诊断,防控和治疗的基础.HDV的研究也为其他病毒的研究提供了材料和支持.本研究就HDV的生物学特征和研究进展进行论述. 1 病毒学特征 HDV颗粒呈球形,直径在35 ～ 37 nm,在氯化铯中的浮力密度为1.25g/cm3.外面被HBV的表面抗原包被,L、M、S三种蛋白的比约为95:4:1,与乙肝病毒的Dana颗粒不同,与22 nm的杆状颗粒相似.[1]     

基因优化对基因工程丁型肝炎小抗原蛋白表达和纯化的影响

目的 探讨基因优化对基因工程丁型肝炎(丁肝)小抗原蛋白表达和纯化的影响.方法 依据GenBank上的丁肝小抗原原始基因,参照大肠埃希菌优势密码子谱进行优化;再分别将优化前后的两组基因进行常规原核表达,用SDS-PAGE电泳比较目的蛋白表达量及优势表达方式;进一步以柱层析进行纯化,再以Image Lab软件分析SDS-PAGE电泳条带,比较两组目的蛋白的纯度.结果 SDS-PAGE显示,两组表达的目的蛋白均与预期相对分子质量大小一致,优化基因组的蛋白表达量高于原始基因组,且更倾向于可溶性表达;经柱层析纯化后,前者的目的蛋白纯度也明显高于后者,可达96.3％.结论 基因优化可提高基因工程丁肝小抗原蛋白表达量,增加可溶性蛋白的比例;且表达产物更易纯化至较高纯度以供诊断使用.     

不同温度、时间、IPTG和菌种浓度对丁肝抗原蛋白表达量的影响

目的确定以大肠杆菌表达丁肝抗原的最佳条件,为规模生产以求研发丁肝ELISA诊断试剂奠定基础。方法在不同温度、时间、IPTG和菌种浓度条件下,分别进行蛋白表达,取等体积样本进行SDS-PAGE电泳,经Image Lab软件分析,比较目的蛋白表达量,确定最佳表达条件。结果在25℃、29℃、33℃和37℃条件下,蛋白表达量无统计意义的差别;在添加IPTG后的1、2、3、4、5和6h,表达量无统计意义的差别;在以0.25、0.5、1、2和4mmol/L IPTG诱导时,表达量无统计意义的差别。当添加诱导剂前,菌种的OD600值分别为1.236、0.772、0.542和0.384,目的蛋白表达量有显著意义的差别。以OD600值为1.236和0.772时,表达量最高,两者之间无统计意义的差别;OD600值为0.542时,表达量次之;OD600值为0.384时,表达量最低。结论温度、表达时间和IPTG浓度在一定范围内对丁肝抗原蛋白表达量无影响;菌种的浓度是影响蛋白表达量的决定性因素;当菌种浓度在OD600值约为0.7～1.2时,以0.25mmol/L IPTG在37℃,诱导表达1h为最佳表达条件。该条件下,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的41.5%。     

实时荧光定量PCR在病毒检测中的应用

实时荧光定量PCR是通过荧光信号监测目的基因扩增数量的定量PCR技术,具有灵敏度高,检测速度快等优点。实时荧光定量PCR已被应用于乙肝病毒、登革热病毒、流感病毒、水疱口炎病毒等病毒的快速检测,在病毒快速分型、相似病毒的鉴别检测、耐药病毒突变体检测等临床和公共卫生领域得到广泛应用。狂犬病是危害严重的人兽共患病,病死率几乎为100%。实时荧光定量PCR技术已被应用于狂犬病病毒和狂犬病相关病毒的核酸检测,具有与金标准DFA相当的灵敏度和特异度,同时克服了金标准DFA的某些局限性,如检测速度更快,无需提取脑组织,对唾液、脑脊液等低病毒载量样本具有较好的检出效果,具有成为人间狂犬病诊断技术的潜力。灵敏度是传统RT-PCR的200倍以上,交叉污染的风险更低。实时荧光定量PCR也应用于欧洲蝙蝠病毒等狂犬病相关病毒的检测,可建立多重实时荧光定量PCR在单一检测体系对多种病毒进行快速鉴别,对于预防病毒性传染病具有重要的公共卫生意义。本文详细介绍了该技术的相关原理和方法,以及在病毒检测方面的国内外研究进展。     

浙江省1株犬源狂犬病病毒全基因组序列测定及细胞分离鉴定北大核心CSCD

目的了解浙江地区狂犬病分子流行病学现状,为浙江地区狂犬病防控提供相关数据。方法使用RT-PCR扩增浙江狂犬病病毒街毒株核苷酸并进行全基因组序列测定,与32株中国狂犬病病毒街毒株基因序列进行比对分析;使用Neuro-2a细胞进行病毒分离,测定不同代次全基因组序列并比较核苷酸突变情况。结果获得了全长为11782 bp的全基因组序列,经过比对分析后发现该毒株属于ChinaⅠ型,与全部参考基因Ⅰ型病毒核苷酸序列一致性为97.10%~99.31%;通过Neuro-2a细胞成功分离到狂犬病病毒,连续三代培养后病毒滴度最终达到5.71×10^(7)FFU/mL,子代之间序列一致性在99.9%以上,其中F3代较F1代核苷酸序列发生了7个位点突变,氨基酸未发生改变。结论新狂犬病病毒分离毒株(ZJSX-2021)属于ChinaⅠ型,与以往分离毒株属同一基因型,表明狂犬病病毒近年在浙江地区仍持续传播。细胞分离后病毒序列并无明显变化。     

狂犬病病毒体外生存活力研究

目的了解狂犬病病毒在体外组织和体液样本中的生存能力。方法通过病毒滴度测定、直接免疫荧光、RT-PCR和病毒分离实验室技术手段对体外组织和悬液中狂犬病病毒生存活力进行验证。结果随着温度升高, 脑组织和悬液中狂犬病病毒活力逐渐下降, 在56℃, 30 min后病毒即失去感染力, 在37℃时, 组织中病毒活力可保持7 d;在pH9.6时, 1 h后无法检测病毒活力;终浓度30%以上乙醇, 500 mg/L以上次氯酸钠和100 mg/L以上苯扎溴铵对悬液中狂犬病病毒作用3 min后即可完全灭活;80%丙酮对组织中狂犬病病毒灭活作用最强, 在浸泡4 h后样本即无法进行病毒分离。结论狂犬病病毒不耐高温, 在pH6.8～7.4环境中较为稳定, 常用消毒剂即可对病毒发挥作用;本实验旨在为狂犬病病毒的体外生存活力提供详细数据, 为下一步狂犬病防控工作开展提供理论支持。