黄芪甲苷调节PI3K/Akt/FoxO1通路抑制糖尿病大鼠肝糖异生

目的:探讨黄芪甲苷对2型糖尿病(T2DM)大鼠肝损伤保护潜在机制及肝组织磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框转录因子1(FoxO1),磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK)和葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase)蛋白表达的影响。方法:6周高糖高脂饮食后,链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射(0.035 g·kg^-1)建立T2DM大鼠模型,随机分为正常组、模型组、黄芪甲苷低、中、高剂量组及二甲双胍组。黄芪甲苷低、中、高剂量组灌胃黄芪甲苷0.02,0.04,0.08 g·kg^-1·d^-1,二甲双胍组灌胃二甲双胍0.2 g·kg^-1·d^-1;给药8周后,于末次灌胃24 h禁食不禁水后处死,测血清肝生化指标,肝脏指数等;采用苏木素-伊红(HE)染色观察肝脏组织病理形态学变化;马松(Masson)染色观察纤维化程度;过碘酸希夫(PAS)染色反应观察细胞内糖原等变化;免疫组化及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组肝中PI3K/Akt/FoxO1信号蛋白及PEPCK,G6Pase蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组肝脏指数显著升高(P<0.01),肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT),天门冬氨酸氨基转移酶(AST),总胆固醇(TC),甘油三酯(TG)的含量显著升高(P<0.01),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)显著降低(P<0.01),大鼠体质量显著减轻(P<0.01),PI3K/Akt/Fox O1信号减弱(P<0.01),PEPCK,G6Pase蛋白表达水平显著增强(P<0.01);与模型组比较,黄芪甲苷中、高剂量组及二甲双胍组肝功能指标ALT,AST,TC,TG的含量明显降低(P<0.05,P<0.01),大鼠体质量明显增加(P<0.05,P<0.01),肝组织Fox O1,PEPCK及G6Pase蛋白水平明显降低(P<0.05,P<0.01),Fox O1的磷酸化水平明显增强(P<0.05,P<0.01)。结论:黄芪甲苷可能通过调节PI3K/Akt/Fox O1信号通路抑制高脂高糖加小剂量STZ诱导T2DM肝糖异生,从而起到延缓T2DM大鼠肝脏损伤作用。     

黄芪甲苷调节miR-21基因抑制肾癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的机制探讨

目的:探讨黄芪甲苷对肾癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法:用终浓度为20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L的黄芪甲苷处理肾癌细胞A498作为不同浓度黄芪甲苷处理组，正常培养的细胞作为对照（NC）组；将anti-miR-con、anti-miR-21转染至细胞A498中，记为anti-miR-con组、anti-miR-21组；将miR-con、miR-21转染至细胞A498中再用80 μmol/L黄芪甲苷处理作为HSJG+miR-con组、HSJG+miR-21组。四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测细胞存活率；蛋白质印迹（Western Blot）检测裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved-caspase-3）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-21表达水平。结果:与对照组相比，不同浓度黄芪甲苷处理组肾癌细胞A498中细胞存活率显著降低，Cyclin D1表达水平显著降低，Cleaved-caspase-3表达水平显著升高，细胞凋亡率显著升高，小鼠肿块重量显著降低，miR-21表达水平显著降低（P＜0.05）。miR-21低表达Cyclin D1表达水平显著降低，Cleaved-caspase-3表达水平显著升高，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。miR-21高表达逆转了黄芪甲苷对肾癌细胞A498增殖抑制和凋亡促进的作用。结论:黄芪甲苷可抑制肾癌细胞A498增殖，促进细胞凋亡，抑制肾癌实体瘤的生长，其机制可能与miR-21表达水平有关。     

冰片对黄芪甲苷和三七总皂苷配伍有效成分在脑缺血/再灌注模型大鼠脑组织分布的影响

目的探讨冰片是否具有促进黄芪甲苷(AST IV)和三七总皂苷(PNS)配伍时主要有效成分透过大脑中动脉栓塞(MCAO)再灌注模型大鼠血脑屏障的作用。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、冰片组、AST IV组、PNS组、AST IV+PNS组、冰片+AST IV+PNS组,制备MCAO再灌注大鼠模型,以液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)测定大鼠患侧与健侧大脑皮层、小脑中AST IV和PNS有效成分(人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1)的含量。结果 AST IV无论是单用还是与PNS、冰片配伍,其口服后主要分布在大脑皮层,尤其是患侧大脑皮层。冰片+AST IV+PNS能使患侧与健侧大脑皮层中AST IV含量显著增加。PNS单用,其有效成分人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1主要分布在患侧小脑。冰片+AST IV+PNS能使患侧大脑皮层中人参皂苷Rb1含量显著增加,使健侧和患侧大脑皮层中人参皂苷Rg1含量增加,使大脑皮层尤其是患侧大脑皮层及小脑中三七皂苷R1含量增加。结论大鼠脑缺血再灌注后,AST IV与PNS的有效成分人参皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1在大脑皮层和小脑均有一定的分布。AST IV单用时,AST IV主要分布在大脑皮层;PNS单用时,人参皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1主要分布在小脑。冰片与AST IV、PNS合用后,能促进AST IV及人参皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1向大脑皮层富集,尤其是向缺血再灌注侧大脑皮层富集;而且能不同程度地促进AST IV,人参皂苷Rb1、Rg1及三七皂苷R1在大脑皮层的吸收,尤其是在患侧大脑皮层的吸收。     

UPLC-MS/MS法同时检测大鼠血浆中参芪扶正注射液主要成分的含量及其药动学

目的：建立超高效液相-三重四极杆质谱联用（UPLC-MS/MS）法同时测定大鼠血浆中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D葡萄糖苷和党参炔苷的浓度,研究参芪扶正注射液在大鼠体内的药动学。方法：血浆样品加入适量内标,50%甲醇-乙腈沉淀蛋白,离心后取上清进样。采用ACE Excel 1.7 C₁₈柱（50 mm×2.1 mm,2.1 μm）,柱温：40℃,流速：0.6 mL·min^-1,流动相由0.1%甲酸水和0.1%甲酸-乙腈组成,采用梯度洗脱,分析时间2.5 min。质谱采用ESI源,正离子检测。大鼠尾静脉注射参芪扶正注射液浓缩液,眼眶采血测定血浆中药物浓度,药动学参数以DAS 3.0软件处理。结果：黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D葡萄糖苷、党参炔苷的浓度分别在5~2 000 ng·mL^-1、2~800 ng·mL^-1、10~4 000 ng·mL^-1内均呈良好线性关系（R ≥ 0.991 5）;日内、日间精密度良好,RSD均小于13.3%（n=6）;提取回收率均在79.0%~97.1%之间,RSD均小于11.4%（n=6）。药动学结果表明,黄芪甲苷、党参炔苷和毛蕊异黄酮-7-O-β-D葡萄糖苷在大鼠体内的AUC_0-t分别为（38.84±17.20）、（23.11±6.84）、（5.32±0.36）μg·min·L^-1,t_1/2分别为（56.44±28.25）、（47.48±9.54）、（10.01±4.42）min,CL分别为（0.15±0.06）、（1.18±0.47）、（0.47±0.11）mL·min^-1·kg^-1。结论：本法简便、快速、灵敏度高、专属性好,可用于参芪扶正口服液大鼠血浆中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D葡萄糖苷和党参炔苷的含量测定及药动学研究。     

黄芪皂苷对不同证型C57BL/6小鼠血清IL-2、IL-4、IgG1、IgG2水平的影响

目的:观察黄芪皂苷对不同证型C57BL/6小鼠血清中白细胞介素(IL)-2、IL-4、IgG1、IgG2水平的调节作用,探讨黄芪皂苷的作用机制。方法:将84只C57BL/6小鼠(雌雄各半)随机分为正常组、肺气虚模型组、肺气虚治疗组、脾气虚模型组、脾气虚治疗组、肾阳虚模型组、肾阳虚治疗组各12只。除正常组外,其余各组小鼠复制3种不同证型的小鼠模型,分别摘眼球取血,采用ESILA法检测各组小鼠血清中IL-2、IL-4、IgG1、IgG2水平。结果:肺气虚治疗组小鼠的IL-2、IgG1、IgG2水平高于肺气虚模型组,IL-4 水平明显低于肺气虚模型组(P均<0.05);脾气虚治疗组小鼠的IL-2、IgG1水平高于脾气虚模型组,IL-4水平低于脾气虚模型组(P均<0.05);肾阳虚治疗组小鼠的IL-2水平高于肾阳虚模型组(P<0.05)。结论:黄芪皂苷可调节不同证型小鼠血IgG1、IgG2水平,提高小鼠对细菌、病毒等外来病原体的抵抗力,能调节小鼠的IL-2/IL-4平衡,使免疫因子水平朝着更有利于机体状况的方向变化。     

黄芪甲苷配伍姜黄素对人卵巢癌HO-8910原位移植瘤转移的抑瘤作用

目的:研究黄芪甲苷配伍姜黄素对人卵巢癌HO-8910原位移植瘤出现转移的抑瘤作用,探讨两者配伍对抗肿瘤是否有协同增效作用。方法:选取已建立荧光蛋白转染的HO-8910卵巢癌动物模型,设G1模型组,G2顺铂组,G3黄芪甲苷组,G4姜黄素组,G5黄芪甲苷+姜黄素配伍组,每组8只。称瘤重并计算抑瘤率;免疫组化法检测肿瘤组织基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP2),B细胞淋巴瘤/白血病-2(apoptosis regulator,Bcl-2)的蛋白表达;实时荧光定量PCR(Realtime PCR)法检测MMP2,Bcl-2及miR21,miR15a,miR200a基因表达。结果:荷瘤鼠经治疗后,与模型组比较,瘤重均有所减小,配伍组瘤重明显低于其他组(P0.05)。免疫组化结果显示,与模型组比较,顺铂组、单体组MMP2,Bcl-2蛋白表达均降低,配伍组明显降低(P0.05);Real-time PCR结果显示,与模型组比较,中药组MMP2,Bcl-2,miR21基因表达均降低,配伍组明显下调(P0.05),miR15a,miR200a基因表达均增强,配伍组明显上调(P0.05)。结论:黄芪甲苷配伍姜黄素对人卵巢癌HO-8910原位移植瘤出现转移后有抑瘤作用,其作用机制可能与抑制MMP2,Bcl-2,miR21表达,上调miR15a,miR200a表达有关,黄芪甲苷配伍姜黄素确有协同增效作用。     

球面对称设计结合遗传神经网络优选黄芪-红花药对水提工艺

目的采用球面对称设计及遗传神经网络优选黄芪-红花药对的水提工艺。方法将黄芪-红花药对水提液中8种有效成分(羟基红花黄色素A、紫丁香苷、毛蕊异黄酮苷、脱水红花黄色素B、山柰酚-3-O-芸香糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、黄芪甲苷)的含量进行赋权,以计算得到的综合得分作为水提工艺的评价指标。在单因素实验基础上,选择液料比、提取时间、提取温度3个因素,依据球面对称设计进行实验,并结合遗传神经网络模型进一步优选黄芪-红花药对水提工艺参数。结果球面对称设计得到的最佳提取条件为液料比20∶1、提取时间30 min、提取温度87℃、提取次数2次,其综合评分为4.877;以遗传神经网络得到的最佳提取条件为液料比22.7∶1、提取时间30 min、提取温度87℃、提取次数2次,经验证该条件下的综合得分为5.004。实验结果显示,遗传神经网络能够提高水提工艺条件的综合评分。结论球面对称设计和遗传神经网络能够优化黄芪-红花药对水提工艺参数,可为中药及其制剂中多种有效成分提取的工艺优选提供参考。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路调控巨噬细胞自噬探讨黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的作用机制

目的观察黄芪甲苷对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的调控,研究黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的作用机制。方法体外细胞实验中,将小鼠巨噬细胞RAW264.7随机分为5组,即对照组、黄芪甲苷组、康士得组、雷帕霉素组以及si RNA组。分别用黄芪甲苷含药血清、Akt抑制剂康士得、mTOR抑制剂雷帕霉素及mTOR-si RNA体外处理RAW264.7细胞48 h,透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,免疫荧光法及Western blotting法检测微管相关蛋白LC3-II表达,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blotting法检测Akt、mTOR及自噬相关蛋白Beclin 1的表达,ELISA检测RAW264.7细胞分泌炎症因子白细胞介素-4(IL-4)、IL-10、IL-2和γ-干扰素(IFN-γ)水平。体内实验采用HE染色检测各组小鼠主动脉横截面病理损伤程度;q RT-PCR和Western blotting法分别检测小鼠主动脉组织中Akt、mTOR的mRNA和蛋白表达。结果体外实验结果显示,与对照组比较,黄芪甲苷含药血清组和各抑制剂组细胞透射电镜下观察到自噬体明显增多(P0.05),LC3-II和Beclin1蛋白的表达水平明显上调(P0.05),而Akt及mTOR的mRNA及蛋白表达水平明显减少(P0.05),巨噬细胞分泌的IL-10明显降低,而分泌的IFN-γ显著增加(P0.05)。小鼠主动脉HE染色结果显示,与模型组比较,黄芪甲苷组小鼠血管各层结构正常,排列整齐,局部有小灶性的钙化颗粒物沉积,病变轻、斑块小,泡沫细胞和脂质减少,弹力板基本完整,病变程度明显较轻,并较各抑制剂组轻。黄芪甲苷组小鼠主动脉组织Akt、mTOR的mRNA和蛋白表达均较低(P0.05)。结论黄芪甲苷抑制动脉粥样硬化斑块的形成机制与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路、抑制炎症反应有关。     

川芎嗪与黄芪甲苷配伍对人脐静脉内皮细胞血管生成的作用及机制探讨

目的研究川芎嗪与黄芪甲苷配伍对缺氧诱导损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖的影响及机制。方法建立HUVECs缺氧损伤模型,将细胞分为5组,对照组、模型组、川芎嗪(80μg/mL)组、黄芪甲苷(40μg/mL)组及川芎嗪(80μg/mL)+黄芪甲苷(40μg/mL)组,MTT法检测川芎嗪、黄芪甲苷及其配伍对缺氧损伤HUVECs增殖的影响;免疫组化法检测缺氧损伤HUVECs细胞VEGF、Ang-II蛋白表达,Western blotting检测VEGF和Ang-II蛋白的表达,RT-PCR检测VEGF和Ang-II mR NA表达。结果与模型组相比,川芎嗪与黄芪甲苷均能提高细胞存活率,川芎嗪与黄芪甲苷配伍组具有极显著差异(P0.001);川芎嗪与黄芪甲苷配伍提高VEGF、Ang-II蛋白表达。同时,川芎嗪与黄芪甲苷配伍组能上调VEGF和Ang-II mR NA的表达(P0.001)。结论川芎嗪与黄芪甲苷配伍可能通过增加血管生成靶向因子VEGF和Ang-II的表达发挥促进血管生成的作用。     

防己黄芪汤HPLC-UV/ELSD指纹图谱研究

目的建立防己黄芪汤(FHD)HPLC-UV/ELSD指纹图谱分析方法,归属和指认复方中主要特征峰。方法采用HPLC法,色谱柱为Venusil MP C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液(梯度洗脱),紫外检测器:检测波长为254 nm,蒸发光散射检测器:漂移管温度为110℃,空气体积流量为3 L/min;进样量10μL;体积流量为1 m L/min。运用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2008版)》对10批FHD指纹图谱进行相似度计算,并对共有峰进行药材归属及成分指认。结果建立了FHD指纹图谱;10批FHD指纹图谱相似度良好;在FHD HPLC-UV指纹图谱中标定了20个共有峰,其中3、6~8号峰来自防己,1、2、4、5、9、12、13、16、20号峰来自黄芪,10、11、13、14、15、17~19号峰来自甘草。在FHD HPLC-ELSD指纹图谱中标定了16个共有峰,其中1’~3’号峰来自防己,4’、7’、9’、11’、13’、15’、16’号峰来自黄芪,5’~8’、10’、12’、14’号峰来自甘草。通过进样对照品、复方以及在复方中加对照品的方式指认出复方中9个成分,分别为9/4’号峰(毛蕊异黄酮葡萄糖苷)、11/6’号峰(甘草苷)、13/7’号峰(芒柄花苷)、15号峰(甘草素)、16/9’号峰(毛蕊异黄酮)、20/15’号峰(芒柄花素),11’号峰(黄芪甲苷)、13’号峰(黄芪皂苷II)、16’号峰(黄芪皂苷I)。结论首次建立了FHD HPLC-UV/ELSD指纹图谱分析方法,该法操作简单、准确,精密度、重复性好,可用于表征FHD中化学成分信息,为FHD质量控制提供了可靠的科学依据。