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1.
人类X盒结合蛋白1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备   总被引:2,自引:0,他引:2  
林建炜  李婧  刘平  郭风劲 《医学争鸣》2009,(22):2533-2536
目的:将以构建的未剪接型X盒结合蛋白1(XBP1u)的原核表达,纯化及人XBP1多克隆抗体的制备.方法:重组质粒pET32a-XBP1u转化入宿主菌E.coliBL2l(DE3),在IPTG诱导下表达,经SDS-PAGE鉴定正确后,用Ni2+-NTA柱式亲和层析法纯化蛋白,将纯化后的目的蛋白经透析袋复性后进行蛋白质定量,再以此蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,末次免疫后心脏取血,采用ELISA法检测抗血清效价;免疫印迹和免疫组化法检测兔抗XBP1u血清的特异性.结果:XBP1u蛋白为包涵体表达,包涵体裂解后经过纯化、复性进行免疫,得到抗血清的效价大于1∶64000,免疫印迹结果出现特异Mr33×103XBP1u条带,免疫组化法在兔肝细胞中成功检测到XBP1u的表达.结论:成功表达和纯化人XBP1u蛋白,并得到高特异性、高效价兔抗XBP1u多克隆抗体.  相似文献
2.
 目的  阐述内质网应激中IRE1α-XBP1信号通路在黑色素瘤细胞增殖中的作用及分子机制。方法  收集61例来自复旦大学附属中山医院的黑色素瘤患者的临床资料并进行分析,病理组织切片行XBP1s免疫组化染色并测定XBP1s的mRNA水平。过表达IRE1α和XBP1s,检测正常黑色素细胞系(HEMn-MP)及黑色素瘤细胞系(Mel-RMu)中IL-6和XBP1s的表达。在黑色素瘤细胞系中过表达IRE1α和XBP1s,联合使用IL-6中和抗体,检测黑色素瘤细胞增殖。结果  人黑色素瘤组织中XBP1s表达显著升高,在正常黑色素细胞系HEMn-MP和黑色素瘤细胞系Mel-RMu中,过表达IRE1α和XBP1s均可上调IL-6表达,且在黑色素瘤细胞系Mel-RMu可促进其增殖,给予IL-6的中和抗体后可部分抵消其促增殖作用。结论 IRE1α-XBP1s-IL-6信号通路通过分泌IL-6介导黑色素瘤细胞的增殖,最终效应由分泌IL-6来实现。  相似文献
3.
目的:探讨依达拉奉对幼鼠惊厥持续状态(status convulsion,SC)后海马内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)关键标志分子X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)mRNA、caspase-12的表达及神经元凋亡的影响。方法:将19~21日龄SD大鼠随机分入惊厥持续状态(SC)组、依达拉奉(ED)组、生理盐水对照(NS)组;各组再按不同时间点分五个亚组。应用氯化锂-匹鲁卡品建立大鼠SC模型,用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)动态观察SC后海马XBP1、caspase-12 mRNA的表达情况。用免疫组织化学方法观察海马caspase-12蛋白表达情况。用TUNEL法观察神经元凋亡细胞数。结果:幼年大鼠海马中XBP1和caspase-12在SC组表达显著增强,与NS组比较差异有显著性(P〈0.01);与SC组比较,ED组XBP1 mRNA表达显著升高(P〈0.01或P〈0.05),caspase-12 mRNA及蛋白表达显著降低(P〈0.01或P〈0.05);SC组在惊厥12 h后的各时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞数均显著高于NS组(P〈0.01),而ED组TUNEL阳性细胞数均较SC组显著下降(P〈0.01或P〈0.05)。结论:依达拉奉有可能通过上调XBP1的表达与下调caspase-12的表达,并使神经元凋亡数目减少,从而发挥对神经元的保护作用。  相似文献
4.
目的 探讨X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)在低浓度皮质酮对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能调控中的作用.方法 分离培养成年健康雄性C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞,应用XBP1-RNAi慢病毒或阴性对照慢病毒感染小鼠腹腔巨噬细胞,采用荧光显微镜观察感染效率,感染3、5 d后收集巨噬细胞提取总RNA,应用RT-PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞XBP1 mRNA表达水平和干扰效率.XBP1-RNAi慢病毒或阴性对照慢病毒感染离体培养的小鼠腹腔巨噬细胞3 d后,再应用低浓度皮质酮(50 ng/ml)处理小鼠腹腔巨噬细胞1 h,分别应用ELISA法及激光共聚焦显微镜检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中TNF-α生成及其吞噬功能变化.结果 当复感染指数(multiplicity of infection,MOI)值≥6时,XBP1-RNAi慢病毒能有效地感染小鼠腹腔巨噬细胞,感染效率>75%.应用RT-PCR检测发现XBP1-RNAi能有效地抑制小鼠腹腔巨噬细胞XBP1基因表达.通过选择性地沉默XBP1基因表达,低浓度皮质酮(50 ng/ml)对巨噬细胞吞噬功能增强的作用受到抑制,巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数均显著下降(P<0.01),而且对TNF-α分泌增强的作用也受到抑制,显著低于阴性对照慢病毒组(P<0.01).结论 采用RNA干扰选择性地沉默XBP1,能有效地抑制低浓度皮质酮对巨噬细胞吞噬和TNF-α生成增强的作用.  相似文献
5.
考察了过量表达CHO细胞的内源性XBP1(X-box binding protein 1)对于重组CHO细胞中乙肝表面抗原(HBsAg)分泌的影响。结果表明:XBP1无法改善DMSO作用下CHO细胞中HBsAg的分泌,但能促进DTT作用下的HBsAg的分泌。进一步研究发现,细胞在DTT作用下形成了内质网分泌压力,而在DMSO作用下,没有形成内质网分泌压力。由此推断在内质网成为分泌限制部位的情况下,XBP1能够促进HBsAg的分泌;而DMSO通过促进二硫键的形成促进了HBsAg在内质网中的分泌,使得分泌限制部位发生在分泌过程中的其他细胞器。  相似文献
6.
目的:探讨X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)对非洲爪蟾胚胎发育的影响。方法:利用Western blot、原位杂交和免疫染色法检测XBP1在胚胎发育各个阶段的表达;通过显微注射基因特异性反义寡核苷酸实现基因敲降,利用RT-PCR和整体胚胎原位杂交法检测基因表达变化。结果:XBP1主要表达于非洲爪蟾胚胎发育期的神经、前肾、胰腺等器官中;敲降XBP1s在胚胎发育早期影响非洲爪蟾胚层形成相关基因,在胚胎发育后期影响胰腺发育相关基因。结论:XBP1s在胚胎发育早期可能影响胚层形成,在晚期可能影响胰腺的发育。  相似文献
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