玳玳果黄酮降脂提取物体内组织分布规律及特征研究

目的：建立UPLC-MS/MS分析方法同时测定玳玳果黄酮降脂提取物效应组分新橙皮苷和柚皮苷在大鼠10种脏器组织中含量，分布规律及特征。方法：采用UPLC-MS/MS技术建立提取物效应组分新橙皮苷及柚皮苷在大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、小肠、脂质、肌肉组织中的定量分析方法；大鼠给药后分别于0.33，0.67，1，4，8 h的5个时间点，分别摘取以上10种脏器组织，测定脏器组织及血液中效应组分的质量浓度，采用DAS（V 2.0）药动学软件对各样本的药物浓度-时间数据进行房室拟合，并计算不同组织效应组分的药-时曲线下面积（AUC）及平均滞留时间（MRT）。结果：所建立的UPLC-MS/MS定量分析方法具备良好的专属性、标准曲线及线性范围良好、方法准确度与精密度、定量下限均符合有关规定；玳玳果黄酮降脂提取物效应组分在血液中的分布符合一室模型，除肾脏及脑组织外，其余脏器中提取物效应组分的房室特征多为静脉注射的二室模型，柚皮苷在肾脏中的拟合结果为非静脉注射的二室模型，新橙皮苷在脑组织拟合结果为静脉注射的三室模型，给药后8 h各组织中效应组分新橙皮苷及柚皮苷AUC值大小顺序均为小肠 > 胃 > 肾 > 脂质 ≈ 脾脏 > 肺 > 肌肉 > 肝 > 心 > 脑，效应组分在各脏器中均无明显蓄积；效应组分在血液、肾脏、肝脏中的滞留时间较长，MRT均大于2 h，脂质最短，MRT不足1 h；各脏器中新橙皮苷的药-时曲线下面积约是柚皮苷的3倍，而心、肝、肾中则是3.5，2.1和3.4倍。结论：玳玳果黄酮降脂提取物效应组分在大鼠组织中分布迅速，达峰时间早于血液；效应组分在肠道内消除缓慢，给药8 h后在各脏器中的含量均显著下降且无特异的蓄积部位。研究结果揭示玳玳果黄酮降脂提取物效应组分在大鼠体内的分布特征及规律，为进一步理解玳玳果黄酮降脂提取物在体内的作用靶点及机制奠定了基础。     

化州柚叶挥发油化学成分的研究

对化州柚叶挥发油进行了气一质联用分析，从化州柚叶挥发油中分离出５９个成分，初步鉴定出１８种化合物，占总量的９１．７０％。这些化合物均为首次报道，其相对百分含量用色谱峰面积归一法测定．     

柚皮苷抑制低氧/复氧致大鼠心肌细胞系H9c2损伤

目的研究柚皮苷(NAR)对H9c2低氧/复氧(H/R)损伤心肌细胞内质网应激的影响。方法将H9c2心肌细胞随机分为对照组(C组)、低氧/复氧组(H/R组)低氧4 h后复氧24 h、柚皮苷10、20和40μg/mL组。于低氧前6 h给予柚皮苷培养再行低氧4 h后复氧24 h。实验后TUNEL检测心肌细胞凋亡;Western blot检测GRP78、ATF6、Bax及Bcl-2蛋白表达。结果与对照组相比,H/R组细胞凋亡增加,GRP78、ATF6、Bax蛋白表达和Bax/Bcl-2比率显著上调,而Bcl-2蛋白表达显著下调(P0.05);与H/R组比较,柚皮苷3个剂量组均可使细胞凋亡减少,GRP78、ATF6、Bax、Bax/Bcl-2比率下调,Bcl-2上调(P0.05),尤其以柚皮苷20和40μg/mL组作用最显著。结论柚皮苷预处理可以降低细胞凋亡,其机制可能与抑制内质网应激有关。     

抗人可溶性间皮素相关蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白(SMR)的单克隆抗体(mAb),鉴定其生物学特性。方法:应用计算机通过综合预测对间皮素(MSLN)进行B-细胞表位预测。合成相应肽段并免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,利用免疫细胞化学和Western blot分析对所制备的mAb进行鉴定。结果:综合预测方法分析间皮素的抗原表位可能于153-162、282-292及471-481氨基酸残基或其附近,选择性合成了可能性最高的位于471-481氨基酸残基的可溶性间皮素相关蛋白表位,制备了mAb(2H10),经免疫细胞化学和Western blot分析该抗体具有较高的特异性。结论:成功地制备了鼠抗人可溶性间皮素相关蛋白的mAb(2H10),该抗体具有较高的特异性,为进一步利用ELISA对可溶性间皮素相关蛋白进行检测奠定了基础。     

柚皮苷调控NF-κB信号通路缓解软骨细胞炎症损伤的作用机制研究

目的：观察柚皮苷对软骨细胞炎症损伤的影响,探索柚皮苷通过干预核因子（NF）-κB信号通路缓解软骨细胞炎症损伤的作用机制。方法：体外培养人软骨细胞,加入细胞培养板,分为正常组、模型组和柚皮苷低、中、高剂量组,除正常组外,其余各组细胞均使用脂多糖（LPS）诱导细胞损伤,柚皮苷各剂量组分别给予不同浓度的柚皮苷（2.5、5、10 μmol/L）进行干预。使用cck-8（cell counting kit-8）法检测各组细胞活力,酶联免疫吸附测定法（ELISA法）检测各组细胞上清中炎症介质白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、一氧化氮（NO）、前列腺素E2 （PGE2）水平,蛋白免疫印迹法（Western blot法）检测细胞内环氧酶（COX）-2、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、IκBα、p-IκBα、p65、p-p65蛋白的表达。结果：模型组软骨细胞活力较正常组明显降低（P<0.01） ,柚皮苷中、高剂量组软骨细胞活力明显高于模型组（P<0.01）。模型组软骨细胞上清中IL-6、TNF-α、NO、PGE2等炎症介质含量均明显高于正常组（P<0.01） ,柚皮苷各剂量组软骨细胞上述指标较模型组有不同程度的降低,以柚皮苷中、高剂量组降低更为明显（P<0.05,P<0.01）。模型组软骨细胞COX-2、iNOS蛋白表达明显高于正常组（P<0.01,P<0.05） ,p-IκBα/IκBα、p-p65/p65比值明显高于正常组（P<0.05,P<0.01）;柚皮苷中、高剂量组软骨细胞上述指标水平或比值均显著低于模型组（P<0.05,P<0.01）。柚皮苷各剂量对上述指标的改善作用均表现出一定的剂量依赖性。结论：柚皮苷可以缓解软骨细胞炎症损伤,其机制可能与调控NF-κB通路有关。     

基于指纹图谱和UPLC-MS/MS定量测定对不同产地陈皮的质量评价研究

目的 采用HPLC指纹图谱与化学计量学相结合、UPLC-MS/MS测定多黄酮成分含量的方法,测定不同产地陈皮质量,为其鉴别和质量控制提供依据。方法 采用HPLC-DAD指纹图谱检测并结合“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012A版）”建立6个产区,49个不同批次陈皮药材（S1～S49）指纹图谱,并进行相似度评价和共有峰确认,结合聚类分析（hierarchical clustering analysis,HCA）、主成分分析（principal component analysis,PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA）等化学计量学综合分析。采用UPLC-MS/MS法建立了8个黄酮类成分柚皮素、柚皮苷、木犀草苷、川陈皮素、橙皮素、橙皮苷、橘皮素和芸香柚皮苷的含量测定方法对60批7个产地陈皮药材进行评价。结果 建立了49批不同产地陈皮药材的指纹图谱,相似度为0.864～0.999,共标定了11个共有峰,HCA分析49批陈皮明显分为4类;PCA得到5个主成分的累积方差贡献率为92.748%;OPLS-DA表明8、7、10和11号峰可能是影响陈皮药材质量的差异标志物;含量测定结果表明不同产地陈皮中黄酮类含量存在显著差异,广东新会以川陈皮素和橘皮素为主要标志成分,四川荷花池以木犀草苷为差异性成分,江西樟树以柚皮素和柚皮苷为差异性成分,广西玉林则以橙皮素、橙皮苷和芸香柚皮苷为主,重庆云阳以川陈皮素和橙皮苷为主。结论 建立了稳定性强的不同产地陈皮HPLC指纹图谱和8个黄酮类UPLC-MS/MS定量测定方法,结合化学计量学可用于陈皮药材综合评价和质量控制。     

HPLC法测定升血调元汤中柚皮苷的含量

升血调元汤是国家中药保护品种 ,由骨碎补、鸡血藤、首乌、党参、北芪等 8味中药制成 ,具有益气养血、补肾健脾的功效。其中骨碎补是方中君药 ,柚皮苷是其主要有效成分。鉴于目前其质量标准中未有定量测定项目 ,为了更好地控制产品质量 ,我们选择了柚皮苷作为指标成分 ,应用 HPLC法进行含量测定 ,以控制升血调元汤的内在质量。结果表明方法简单、准确、快速。1　仪器与试剂日本岛津 LC- 1 0 A高效液相色谱仪 ,7530 G分光光度计 (上海分析仪器厂 ) ,柚皮苷对照品购自中国药品生物检定所 ,升血调元汤均为本公司生产 ,甲醇、醋酸均为分析纯…     

负载柚皮苷AKE/GB30网箱在脊柱骨缺损模型修复中的作用及对BMPs-VEGF信号通路的影响

【摘要】 目的：观察负载柚皮苷的AKE/GB30网箱在脊柱骨缺损模型中的修复作用,并基于骨形成蛋白（BMPS）-血管内皮生长因子（VEGF）信号通路探讨该生物材料的作用机制。方法：用牙钻在30只新西兰雄兔L5与L6椎间制作一个7mm×5mm×4mm的缺损,建立脊柱骨缺损模型,制备AKE/GB30网箱。测试负载柚皮苷的AKE/GB30网箱生物力学性能,检测其体外释药行为。将造模成功的新西兰兔随机数字表法分为3组,即空白组、自体骨移植组、骨移植生物材料+柚皮苷联合组,除空白组外分别予以自体骨移植、负载柚皮苷的AKE/GB30网箱进行修复。术后6周、12周每组各取5只兔,微计算机断层扫描（Micro CT）检测骨修复情况[包括骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数目（Tb.N）];实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测骨形成蛋白2（BMP2）、VEGF、Runt相关转录因子2（RUNX2）、碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）信使核糖核酸（mRNA）表达;免疫印迹法（WB）检测骨组织BMP2、VEGF、RUNX2、ALP、OCN蛋白表达。结果：AKE/GB30网箱制作成功,且其特性检测结果符合脊柱骨缺损修复要求;负载柚皮苷的AKE/GB30网箱最大抗压强度为28MPa,最大抗压力为15N,6周时其累积释药率达（98.15±1.47）%;各组术后12周时BV/TV、Tb.Th和Tb.N,骨组织BMP2、VEGF、RUNX2、ALP、OCN的mRNA与蛋白表达均高于术后6周时（P＜0.05）,且自体骨移植组、骨移植生物材料+柚皮苷联合组上述指标均高于空白组（P＜0.05）,自体骨移植组、骨移植生物材料+柚皮苷联合组上述指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论：负载柚皮苷的AKE/GB30网箱在脊柱骨缺损模型修复的效果等同于自体骨移植,可能是通过促进BMP2、VEGF、RUNX2、ALP、OCN表达实现的。     

正交实验法优选骨碎补提取工艺的研究

目的：研究骨碎补的提取工艺。方法：以骨碎补总黄酮及柚皮苷含量为指标，采用正交实验法进行优选，并用紫外分光光度法测定总黄酮的含量．HPLC法测定柚皮苷含量。结果：提取次数是骨碎补有效成分提取的关键因素，其次是溶媒用量．乙醇浓度和提取时间为最次要因素。结论：最佳提取工艺为骨碎补用10倍量60％乙醇回流提取3次．1h/次。