CpG寡脱氧核苷酸对慢性哮喘小鼠模型气道炎症的预防作用

目的研究含非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）寡脱氧核苷酸（CpG-oligodeoxynueleotides,CpG- ODN）能否预防或减轻慢性哮喘小鼠气道炎症的发生。方法40只雌性C57BL／6小鼠随机均分为4组,A组（慢性哮喘组）、B组（CpG-ODN干预组）和C组（GpC-ODN对照组）分别腹腔注射卵蛋白致敏,然后用卵蛋白雾化吸入激发以制作慢性哮喘模型,D组（生理盐水对照组）用生理盐水进行致敏和激发。B组在致敏同时（d1, d14）和激发阶段（每2周1次）分别给予60μg／mLCpG-ODN腹腔注射,共6次。C组将CpG替换为鸟嘌呤-磷酸-胞嘧啶（GpC）作为对照。在末次激发24 h后,取血测嗜酸粒细胞（eosinophil,EOS）数,血清IgE、IgG1和IgG2α;收集支气管肺泡灌洗液（bronehoalveolar lavage fluid,BALF）作细胞分类计数;测定肺组织中白介素-4 （interleukin-4,IL-4）、白介素-13（interleukin-13,IL-13）和γ-干扰素的mRNA（interferon-γ,IFN-γ）表达量;以及肺组织病理学检查。结果A组外周血EOS数[（89±10）×10^4／mL]、血清IgE值[（279±53）ng／mL）、IgG1（A值2．151±0．628）、IgG2α（A值0．772±0．245）、BALF中EPS（6．3±1．3）]×10^5／mL）及百分比[（18．1±3．0）％]较D组明显增高（P〈0．01）;且肺组织中IL-4、IL-13和IFN-γ等细胞因子mRNA表达量[（分别为（5．72±3．89）×10^-2、（9．45±5．91）×10^-2和（3．23±1．69）×10^-2）]也明显高于D组（P〈0．05）。用CpG-ODN干预后（B组）,除IgG2α（A值1．186±0．414）和IFNγmRNA表达量[（18．91±9．85）×10^-2]增高外（P〈0．05）,其余指标均低于A组（P〈0．05）。C组的上述各指标与A组相比差异均无显著性（P〉0．05）。结论CpG- ODN对小剂量OVA反复激发所致的慢性气道炎症有一定的预防作用。     

肠道病毒71型快速培养鉴定方法的建立和应用

目的:建立肠道病毒71型(EV71)快速培养鉴定方法,并应用于EV71感染的早期诊断。方法:1.以不同滴度的EV71临床分离株,低速离心接种于人横纹肌肉瘤细胞(RD)96孔板内,设定时间梯度培养后用间接免疫荧光技术检测EV71早期抗原,以优化快速培养鉴定方法的条件。2.采集上海地区2010年手足口病例患者的咽拭子、大便标本50份,以EV71快速培养鉴定方法检测,并与病毒分离培养比较。结果:病毒滴度为106TCID50/0.1 ml的EV71临床分离株系列稀释后培养3 d,至最高稀释度10-10能100%检测到病毒抗原。检测咽拭子标本5份、大便标本45份,病毒分离检测阳性26份,出现CPE平均时间为9.8d±2.098,阳性率为52.0%;快速培养鉴定方法3 d检出阳性30份,阳性率为60.0%。结论:在96孔板上开展离心培养结合免疫荧光技术应用于EV71感染的早期诊断,缩短了病原体检出时间、敏感性高、特异性强,操作更为简便,是快速诊断EV71感染的可靠方法。     

ADAM33基因在慢性哮喘小鼠气道重塑中的表达

目的:研究ADAM33(a disintegrin and a metalloproteinase 33)mRNA在慢性哮喘小鼠模型气道重塑中的表达.方法:20只雌性C57BL/6小鼠随机分为2组,每组10只.A纽(慢性哮喘组)分别于第1、14天小鼠腹腔注射1 mL致敏液,从第21天开始雾化吸入2.5%的卵蛋白(OVA)溶液,每次30 min,每周3次,连续8周.(2)B组(生理盐水对照组)给予生理盐水进行致敏和激发.在末次激发24 h后,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)做细胞分类计数.用实时定量反转录多聚酶链反应(real-time RT-PCR)法测定肺组织中ADAM33、白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13)mRNA表达量.取左肺组织分别行苏木紫-伊红(HE)染色和Masson's Trichrome染色,用抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体行免疫组化染色.结果:A组BALF中嗜酸粒细胞[(6.3±1.3)×105/mL]及百分比[(18.1±3.0)%)]、肺组织中ADAM33、IL-4和IL-13等mRNA表达量[分别为(1.41±0.93)×10-2(5.72±3.89)×10-2、(9.45±5.91)×10-2)]与B组相比明显增高(P＜0.01).而且Masson's Trichrome染色示上皮下胶原纤维沉积增加、α-SMA免疫组化示气道平滑肌层明显增厚.结论:ADAM33 mRNA在小剂量OVA反复激发复制的慢性哮喘小鼠模型中表达增加,可能参与气道重塑的发生和发展.     

丙型肝炎病毒1b亚型E2区序列与干扰素治疗应答的关系

目的探讨上海地区丙型肝炎病毒(HCV)1b亚型感染者E2区的高变区1(HVR1)和高变区2(HVR2)、双链RNA激活的蛋白激酶真核翻译启动因子磷酸化同源区域(PePHD)及其邻近区域的基因序列与干扰素应答的相关性。方法收集上海地区24例HCV1b慢性感染者在α干扰素治疗前后及随访过程中的血清标本,用逆转录聚合酶链反应扩增E2区的HVR1、HVR2、PePHD及其邻近区域的基因并进行测序和氨基酸同源性分析。结果治疗前的HVR1区氨基酸序列高度变异,基于HVR1序列的种系发生树提示序列变化与干扰素应答类型无关。持续应答组(SR)、无应答组(NR)和复发组(TR)治疗前的HVR2区平均氨基酸变异数分别为2.0、1.0和1.5,统计学分析显示SR组与NR组差异有显著性(t=3.098,P<0.05)。治疗前的PePHD序列高度保守,无1例存在氨基酸变异。观察4例NR患者治疗过程中的PePHD序列,也未发现有任何氨基酸的突变。进一步比较PePHD邻近区域的氨基酸序列发现存在个别位点的变异(平均氨基酸变异SR组6.67,NR组5.75,TR组7.43),但变异的多少与疗效无关(SR组∶NR组t=1.413,P=0.195;SR组∶TR组t=1.706,P=1.107;TR组∶NR组t=0.682,P=0.504)。结论与HCVE2基因的HVR1区、PePHD区及其邻近区域序列与患者对干扰素的应答无相关性比较,HVR2区的序列变化可能与干扰素应答存在     

三个品系小鼠流感病毒气溶胶感染模型的比较

[摘要] 目的 通过气雾攻击产生气溶胶的感染方式对三个品系的小鼠分别进行感染,比较三个品系小鼠在感染过程中的感染差异,从而对三个品系小鼠流感模型的特点进行分析,为流感发病机制的研究及疫苗和药物的开发选择合适的感染模型提供参考。方法 选用A/Puerto Rico/8/34（H1N1）病毒株,采用气雾攻击的方法感染近交系C57BL/6、BALB/c和远交群 ICR三个品系的小鼠,每日称小鼠体重,肉眼观察小鼠状态,分别于感染后3d,7d,14d处死小鼠,取肺脏称其湿重,进行肺脏的病毒测定及病理观察。结果 三个品系小鼠均可感染,其中C57BL/6小鼠的存活率低于其他两个品系,3d 的肺指数和病毒载量均明显高于ICR小鼠（P<0.05),镜下病理结果显示较其他两个品系也更明显。BALB/c小鼠与其他两个品系小鼠相比,体重在后期的恢复最慢,存活率比 C57BL/6高但比ICR低;肺指数和病毒载量与其他两个品系相比没有显著差异;镜下病理改变相似,但弱于C57BL/6强于ICR。ICR小鼠的发病进程与其他两个品系小鼠基本相似,但体重、存活率、肺指数、病毒载量及镜下病理改变等指标均弱于其他两个品系。结论 三个品系小鼠均可建立流感气溶胶模型,但感染后的三个模型各有特点,在实验中可以根据不同的研究目的来选用合适的小鼠品系建立模型。     

呼吸道合胞病毒感染小鼠Th17细胞亚群的变化

目的观察辅助性T淋巴细胞17（Th17）在呼吸道合胞病毒（RSV）感染小鼠肺部炎症中的变化,探讨其在RSV感染后宿主免疫机制中的作用。方法 30只3～5周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组（18只）和对照组（12只）。实验组每只小鼠鼻腔滴入0.1 mL滴度为107.5TCID 50/mL的病毒液,对照组鼻腔滴入0.1 mL的2.5%灭活鸡血清的DMEM维持液。在处理后的第1、4、8 d分别处死小鼠,并留取肺脏和肺门淋巴结。用HE染色观察RSV感染后肺组织病理变化;实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测肺组织中RSV-F、IL-17A、IL-17F和IL-23p19 mRNA表达水平;流式细胞术检测小鼠肺门淋巴结中Th17细胞水平。结果在RSV感染后第4 d小鼠肺组织出现典型间质性肺炎表现,第8 d炎性细胞明显减少;肺组织中RSV病毒的相对表达量在第4 d为9.208±0.548,较第1 d显著增多（P〈0.01）,到第8 d则较第4 d显著减少（P〈0.01）;肺组织中IL-23p19和IL-17A等细胞因子的表达在RSV感染后也呈现增高的趋势,并在第4 d达到高峰,但IL-17F mRNA表达在RSV感染后不同时间点与对照组比较无显著变化（P〉0.05）;RSV感染后第4 d和第8 d小鼠肺门淋巴结Th17亚群比例分别为（0.370±0.043）%和（0.853±0.048）%,均明显高于相应的对照组（P〈0.05）,而且第8 d的Th17比例也显著高于第4 d（P〈0.01）。结论在RSV感染小鼠导致的肺部炎症反应过程中,出现肺组织中IL-17A的表达增加和肺门淋巴结Th17细胞水平增高,说明Th17细胞可能参与宿主的抗病毒免疫过程。     

上海地区2009年至2010年婴儿呼吸道感染病毒谱系的特征

目的 使用Seeplex(R)RV15 ACE检测试剂盒检测上海地区婴儿呼吸道感染病毒的病原谱系.方法 征集新华医院儿科呼吸道发热门诊0～1岁组患儿62例,以咽拭子对呼吸道分泌物采样,提取样本中病毒核酸,反转录合成cDNA,使用Seeplex(R)RV15 ACE检测试剂盒扩增15种呼吸道病毒的目的 基因,以琼脂糖凝胶电泳检测特异性产物条带,判定感染病毒.并以检出病毒与检出季节和临床特征进行比较.数据采用Fisher's精确检验和卡方检验.结果 62例呼吸道感染患儿从咽拭子中检出病毒阳性36例,占58.1%,其中呼吸道合胞病毒B型(RSV-B)、鼻病毒、腺病毒、肠道病毒(hEV)、冠状病毒229E-NL63、A型流感病毒、副流感病毒1型和3型、博卡病毒、偏肺病毒、B型流感病毒的检出率分别为12.9%、11.3%、11.3%、8.0%、6.5%、6.5%、4.8%、4.8%、1.6%、1.6%和1.6%.检出双重感染6例,三重感染1例,多重感染占阳性病例的19.4%(7/36).冬季RSV-B检出率,高于其他三季(Fisher's精确检验,P=0.001),夏季检出hEV高于其他三季(Fisher's精确检验,P=0.01).结论 RSV-B、鼻病毒和腺病毒是上海地区婴儿呼吸道感染的前三位病毒病原体,多重病毒感染常见.

Abstract：

Objective To investigate the etiology spectrum of respiratory viral infection in the infants in Shanghai by using Seeplex(R) RV15 ACE Detection kit. Methods Sixty-two throat swab samples were collected from the infant patients under one-year age, who were admitted to pediatric clinic in Xinhua Hospital during June, 2009 to June, 2010. Among these samples, 15 species of respiratory virus were amplified by using Seeplex(R) RV15 ACE Detection kit. Identified viruses were analyzed for their seasonal distribution pattern and clinical infectious symptoms. The data were analyzed by Fisher's exact test and chi square test. Results Viruses were successfully detected from 36 swab samples (58. 1％). Among them, respiratory syncytial virus-B (RSV-B), human rhinovirus (hRV) and adenovirus (ADV) accounted for 12. 9％, 11. 3％ and 11. 3％ of the infections, respectively. Other detected viruses included human enterovirus (hEV) (8.0％), influenza virus A (FluA) and coronavirus 229E-NL63 (each 6. 5％), parainfluenzavirus (PIV)-1 and PIV-3 (each 4. 8％), human Boca virus (HBoV), human metapneunovirus (hMPV) and influenza virus B (FluB) (each 1. 6％). Dual infections were identified in six cases and triple infections in one case, which as a whole accounted for 19. 4％ of positive cases (7/36). RSV-B infection in winter was significantly higher than the other three seasons. Of the detection rate (Fisher's exact test, P = 0. 001), hEV infection in summer was significantly higher than the other three quarters (Fisher's exact test, P = 0.01). Conclusions RSV-B, hRV, and ADV are the three most common etiologies in respiratory viral infection in the infants under one-year age in Shanghai area. Multiple infections are also common.     

乙肝病毒携带产妇血浆与初乳中病毒含量的相关性研究

目的 探讨乙肝病毒携带产妇血浆及初乳中病毒含量的差异性及其临床意义.方法 选取20例乙肝病毒携带产妇作为实验组,21例乙肝表面抗原阴性的健康产妇作为对照组,采用RT-PCR法检测实验组及对照组血浆及初乳中HBV DNA病毒含量.结果 对照组产妇的初乳和血液中HBV DNA均检测阴性.实验组产妇初乳中HBV DNA含量与血浆中HBV DNA含量有一定相关性,Ct值和病毒载量相关系数r分别为0.7731和0.8053,P值均小于0.0001.实验组血浆中HBVDNA含量明显高于初乳中HBV DNA含量10～1000倍(P＜0.0001).当血浆HBV DNA国际单位(IU)的Log值下降到4.7以下时,75％的乙肝病毒携带产妇初乳中病毒DNA是低于检测限.结论 血浆和乳汁中HBV DNA载量较低的乙肝病毒携带产妇可结合其它临床检测指标部分考虑采取母乳喂养.     

上海地区丙型肝炎病毒基因分型的研究

目的 研究上海地区不同人群中丙型肝炎病毒基因型的分布和频率。方法 应用新改进的第二代谱线探针分析（Ｌｉｎｅ Ｐｒｏｂｅ Ａｓｓａｙ,ＬｉＰＡ）试验盒,对１０９份血清的ＨＣＶ ＲＮＡ逆转录－巢式ＰＣＲ阳性分离物进行了基因分型。结果 ８１份丙型肝炎患者ＨＣＶ分离物中７１份（８６．７％）为１ｂ型,４份（４．９％）为２ｃ型,２份（２．５％）为３ｂ份,１份（１．２％）为６ａ型,２份（２．５％）为混合型９２／