铜绿假单胞菌噬菌体PaP3生物学特性的研究

目的测定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3的最佳感染复数、一步生长曲线和吸附K值及交叉吸附K值等基本生物学特性。方法按照感染复数（MOI）分别为0．0001、0．001、0．01、0．1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌，充分裂解细菌后，测定噬菌体滴度；以MOI=10的比例加入噬菌体及宿主菌，进行一步生长实验；纯化PaP3颗粒，免疫家兔，获得抗血清，通过中和反应实验测定PaP3和其抗血清之间的吸附反应常数K值。同时，利用抗血清交叉中和试验确定本室分离的三株噬菌体之间的血清学关系。结果当MOI=0．001时PaP3感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高；根据一步生长实验结果绘制一步生长曲线；通过血清交叉中和反应得出不同的吸附常数。结论PaP3最佳感染复数为0．001，感染宿主菌的潜伏期是20min，爆发期是60min，平均爆发量约为31，其抗血清反应的吸附常数K值为262。     

噬菌体基因组PaP1的鸟枪法测序及其生物信息学分析

目的对分离的铜绿假单胞菌噬菌体PaP1进行全基因组测序，并进行初步的生物信息学分析，为噬菌体的改造及其治疗奠定基础。方法采用鸟枪法随机测序和重叠群组装的策略对PaP1进行基因组测序，并通过EditSeq、开放读码框架（ORF）finder、GeneMark^TM、BPROM、FindTerm、Palindromes、Equicktandem及FAStRNA等软件对所获得的基因组序列的一般特征、蛋白质同源性序列及tRNA基因等进行分析和预测。结果PaP1基因组约为90000bp，其中最大重叠群为28249bp。在已获得序列中预测出120个ORFs、41个推定基因及9个簇集在5’末端的tRNA基因。在41个推定基因中，预测出编码DNA末端酶大亚单位、DNA解旋酶B亚单位、肽聚糖结合蛋白及3个尾丝蛋白等6个基因的功能。结论鸟枪法只能测出噬菌体基因组PaP1的部分序列，重复序列的存在是该基因组测序困难的原因。     

高温变性对双链DNA分子的损害

高温变性是实验室常用的方法 ,如用煮沸法提取质粒ＤＮＡ ,用煮沸法变性ＤＮＡ检测样品或ＤＮＡ双链探针 ,以及在ＰＣＲ中使用 94℃变性模板等[1～ 3] 。这给我们留下一个强烈印象 :即核苷酸链是耐高温以至可以接受煮沸处理的。基于这一事实 ,最近我们使用煮沸法来灭菌欲无菌保存的ＤＮＡ样品 ,结果意外发现 10 0℃加温处理可以不同程度地损害ＤＮＡ分子 ,引起了我们对高温变性处理双链ＤＮＡ分子的高度重视 ,特设计实验观察高温对ＤＮＡ损害的程度以及高温对不同来源ＤＮＡ的损害是否有差异。现将结果报告如下。1　材料与方法1 1　实验材料…     

肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的 构建表达人源肽抗生素hPAB-β的重组毕赤酵母,为大量制备hPAB-β奠定基础.方法 用PCR及引物延伸法得到天然及优化的hPAB-β序列,克隆入pPIC9K质粒,转化DH5α大肠埃希菌,用酶切和核苷酸测序鉴定.重组质粒经SalⅠ酶线性化,整合入毕赤酵母GS115中,在DNA,mRNA及蛋白水平鉴定阳性重组子.结果 构建的含天然及优化序列的重组质粒酶切均可得到相应大小的插入片段,与预期相符,测序结果表明序列和阅读框均正确.线性化的重组质粒转入GS115后,得到7个不同的高拷贝阳性转化子,均能表达重组肽并具有良好的抑菌活性.结论 本研究成功构建含天然及优化hPAB-β序列的重组毕赤酵母工程菌,能够用于肽抗生素hPAB-β的制备.     

细菌对噬菌体感染的抵抗

噬菌体对其宿主菌具有特异性感染力,反之,宿主菌对噬菌体的感染具有抵抗现象.根据噬菌体侵入宿主的不同阶段,可以将宿主菌对噬菌体的天然抵抗机制分为4个主要的类别吸附抑制,流产感染,限制-修饰系统和穿入阻滞.此外,还有源于噬菌体的抗性作用以及通过人工插入突变获得的广谱噬菌体抗性菌株等.     

铜绿假单胞菌外毒素A的表达、纯化与生物学活性研究

目的利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A(PE),为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础。方法应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因,将其克降于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109, IPTG诱导表达;制备融合蛋白包涵体,并采用Ni-NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白;采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性,MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性。结果通过对PCR反应体系的优化,扩增到了PE全长结构基因。所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(M_r)约为66×10~3,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达。经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95%。MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度(IC_(50)值)分别为2.13μg/ml、2.58μg/ml。结论通过对PE的表达纯化,获得了具有细胞毒活性的重组PE,为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础。     

Cathelicidin的特性及其应用

Cathelicidin是在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽之间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidin 和防御素一样，也是宿主免疫防御系统的重要组成部分。除了主要的抗菌活性以外，Cathelicidin还具有抑制组织损伤，促进创伤修复，结合内毒素，诱导血管生成等多种生物学功能。在临床耐药菌问题日益严重的今天，进一步了解Cathelicidin的生物学活性和临床作用，无疑将推动整个抗感染治疗事业的发展。     

西南地区基因重组微生物研究生物安全管理的现状调查及对策研究

目的了解西南地区基因重组病原微生物的安全管理现状，并提出相对应的管理办法与措施。方法采用问卷调查的方式对西南地区内从事基因重组微生物研究的实验室从课题承担情况、实验室生物防护和管理情况、人员培训和教育情况等方面进行了抽样调查，对调查结果进行了分析。结果在各实验室，基因重组技术研究和应用范围广泛；有关生物安全的基础设施有待改善，实验室防护级别不够；生物安全规章制度执行力度还有待加强；人员培训有待规范化、制度化。结论应加强有关法规制度和管理体系的建设，注重对人员的宣传、培训和管理以及加强生物防护设施建设等。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3整合位点的鉴定

目的：确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3在宿主菌基因组中的整合位点.方法：利用在噬菌体PaP3基因组中无酶切位点的Pst Ⅰ对溶原性细菌全基因组进行酶切,获得含有噬菌体PaP3全基因组及部分宿主菌DNA序列的大片段;然后进行第二次酶切,获得噬菌体基因组与宿主菌基因组的交界点序列,并进行克隆、测序,鉴定出杂合位点attR.根据λ噬菌体的整合机制,利用PCR反应扩增出另一杂合位点attL,根据测序结果及Blast检索确定attP与attB的位置和DNA序列.结果：经序列比对发现,attP及attB的核心位点分别位于噬菌体PaP3基因组中的t-RNAPro基因及铜绿假单胞菌PA3基因组中的t-RNALys基因中,其核心位点的DNA序列为21 bp（5＇-GGTCGTAGGT-TCGAATCCTAC-3.）.在核心位点的两侧存在正向重复序列及反向重复序列.结论：该研究为铜绿假单胞菌噬菌体的整合酶及整合机制的研究奠定了基础.