人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒（Ad-hKLK1-IRES-EGFP）,并观察在自发性高血压大鼠（SHR）血管平滑肌细胞（VSMCs）中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1，将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中，构建成重组穿梭质粒 ，将其与腺病毒骨架质粒BHGloxE1，3Cre共转染293A细胞，经包装并获得重组腺病毒，用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定，测定病毒滴度；用重组腺病毒感染VSMCs，用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率，用RT－PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确，并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP，其滴度为4.5×10¹¹/L。重组腺病毒感染VSMCs后，在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达，感染率高达90％以上，可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达，并与感染时间(1 d-7 d) 有显著依赖关系，峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP；感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达，该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。     

人组织激肽释放酶基因的克隆及测序分析

目的 克隆中国人组织激肽释放酶基因,为开展基因治疗高血压研究奠定基础。方法 提取人胰腺组织总RNA,逆转录后进行PCR扩增。将PCR产物回收、插入质粒KS,酶切鉴定后双向测序分析。结果 本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比,有一个碱基不同,同源性为99.8%。结论 克隆的中国人组织激肽释放酶基因可用于基因治疗等深入研究工作。     

荧光蛋白标记的促红细胞生长素融合蛋白的设计和预测

目的：探讨pTRE顺式作用元件调控，EGFP标记hEPO(hEPO-EGFP)融合蛋白设计的合理性。方法：应用Gene Construction Kit2．5、www．expasy．com网站提供的分析方案，分析重组体的开放读框以及融合蛋白的柔性．并作蛋白质二级结构模拟。结果：重组体的转录受pTRE顺式作用元件调控，Linker所在部位柔性高，融合蛋白表达后，二级结构预测Linker不改变蛋白结构，完全符合作者设计EGFP标记hEPO融合蛋白的初衷。结论：重组蛋白设计合理，融合蛋白有很大可能保留了hEPO和EGFP的理化特性，为进一步的实践操作提供了可靠的理论基础。     

华法林抗凝治疗维持剂量与CYP2C9基因突变的关系

目的 探讨心脏瓣膜置换术后需长期口服华法林抗凝治疗的患者华法林维持剂量与细胞色素P4502C9(CYP2C9)基因CYP2C9*3(Ile359Leu)突变的关系.方法 93例心脏瓣膜置换术后需长期口服华法林抗凝治疗患者根据国际标准化比值(INR)1.5～2.0调整华法林的用量,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法(PCR-RFLP)检测CYP2C9*3的突变情况,根据有无突变进行分组,比较有突变组和无突变组患者每周华法林的维持剂量.结果 93例口服华法林抗凝治疗患者中检测出CYP2C9*3突变的有14例,无突变的79例,突变组每周华法林维持剂量为(15.22±5.49)mg,无突变组每周华法林维持剂量为(19.83±5.99)mg,突变组华法林的维持剂量明显低于无突变组,两组间差别有统计学意义(t＝2.686,P＜0.05).结论 CYP2C9*3突变是不同个体间华法林维持剂量出现差异的主要原因之一,为了降低使用华法林时发生不良反应的风险,在口服华法林抗凝治疗时应检测CYP2C9*3的突变情况.     

肥胖男性β3肾上腺素能受体基因多态性研究

目的研究单纯性肥胖男性β3肾上腺素能受体（β3-adrenergic receptor，β3-AR）Trp64Arg多态性的分布情况及对肥胖类型的影响。方法利用聚合酶链式反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）方法检测单纯性肥胖患者及正常对照β3-AR基因Trp64Arg突变。进一步比较不同类型肥胖中突变的发生率。结果β3-AR基因Trp64Arg突变频率在正常对照组、周围性肥胖组及中心性肥胖患者中分别为16．67％、21．05％、34．78％，Arg等住基因在3组中的频率依次为8．33％、10．53％、19．57％。中心性肥胖患者Trp64Arg突变及Arg等住基因频率较正常对照及周围性肥胖者明显增加，但无统计学差异。结论β3-AR基因Trp64Arg突变可能与男性单纯肥胖者腹内脂肪积聚有关，对此需进一步扩大样本后加以研究。     

肾脏疾病基因治疗研究进展

本文简要综述目前基因治疗常用载体系统的优、缺点，以及针对肾脏进行基因转移的策略和应用前景。     

重组人组织激肽释放酶基因转染人脐静脉内皮细胞

目的探讨重组人组织型激肽释放酶(HK)基因腺相关病毒载体(rAVV/HK)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作用.方法将HK基因定向克隆入腺相关病毒质粒pAAV-MCS中,形成重组腺相关病毒(rAAV-HK)质粒,经聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序后,将rAAV-HK、pAAV-Helper和pAAV-RC 3种质粒通过脂质体共转染293细胞,包装成带有HK目的基因的重组rAVV/HK,采用β半乳糖苷酶原位染色法测定报告基因rAVV/LacZ在HT1080中的表达,间接计算病毒滴度,并观察转染基因在传代细胞中的表达.在相同的条件下体外分别培养HUVECs(对照组)和rAVV/HK转染的HUVEC(HK转染组)48 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测两组HUVECs HK mRAN的表达,并利用硝酸还原酶法和分光光度法分别检测两组HUVECs一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性.结果 rAVV/HK病毒滴度为6.2×107个/mL,LacZ基因能够在第一传代和第六代HT1080细胞内稳定持续表达.与对照组比,HK转染组HUVECs HK mRNA表达增加(P<0.001);而且HK转染组HUVECs细胞培养液中NO的含量和NOS活性明显增高,P值分别<0.01和<0.05.结论 HK基因通过重组腺相关病毒载体可成功转染体外培养的HUVECs,使其HK mRNA表达增加,NOS活性和NO含量升高,此结果为基因治疗人类血管内皮细胞异常提供客观依据.     

核酸杂交检测HBV DNA及基因分型

检测血清中HBVDNA并进行基因分型。采用聚合酶链反应（PCR）扩增HBV DNA后，采用不同的探针，利用微板杂交法将其分为六个亚型。50例广东地区HBVDNA阳性病人中C型占68％（34例），B型占10％（5例），D型占6％（3例），F型占2％（1例），另有8％为混合型（3例BC，1例BCD），没有发现A型和E型，3例分型结果阴性，为未定型。广东地区HBV基因亚型以C型为主，B型次之，其它较少。可能存在其他亚型。