人参中苯甲酸胁迫响应基因WRKY7的克隆与表达分析

WRKY转录因子是高等植物中最重要的转录因子基因家族之一,其在植物形态建成、生长发育以及应对生物(病菌、害虫等)、非生物(干旱、盐、冷、热等)胁迫过程中发挥重要作用。该研究根据人参化感自毒物质苯甲酸诱导的人参转录组数据,设计全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得1条编码WRKY转录因子的基因,暂命名为WRKY7,并对其进行TA克隆、测序和序列分析。该基因cDNA全长1 216 bp,其开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 014 bp,编码337个氨基酸。序列分析及系统进化分析表明,该蛋白属于WRKY家族第Ⅲ类成员,与西洋参种的WRKY6转录因子亲缘关系最近,同源性为87%。实时荧光定量PCR分析发现,苯甲酸胁迫后WRKY7的表达量显著升高,推测该基因可能参与了人参响应苯甲酸胁迫的过程,为进一步研究人参自毒胁迫响应的分子机制奠定了基础。     

天麻钩藤饮含药血清对MPP~+诱导PC12细胞损伤保护作用的研究

目的:观察天麻钩藤饮含药血清对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(1-methyl-4-phenyl pyridinium,MPP+)诱导的PC12细胞凋亡的影响,并且探讨其作用机制。方法:将48只大鼠随机分为空白组、美多巴组、天麻钩藤饮2.85、5.7、11.4、22.8g/kg剂量组,天麻钩藤饮按照相应剂量灌胃,空白组灌胃等体积生理盐水,美多巴片(0.05g/kg)溶于生理盐水灌胃。采血制备含药和空白血清,常规培养PC12细胞,空白组和模型组给予空白血清,其他5组给予10%含药血清,孵育30min后,再加500μmol/L MPP+共孵育48h后收集细胞,采用MTT法检测细胞存活率,LDH释放检测细胞毒性,Annexin V/PI染色流式细胞术检测PC12细胞凋亡,Western blot检测Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平,分光光度法检测Caspase-3及Caspase-9活性。结果:模型组较空白组细胞活力明显降低,LDH释放率增加,诱导细胞发生凋亡,同时Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平增加,而Bcl-2蛋白表达降低,Caspase-3及Caspase-9活性明显增加。与模型组比较,10%的天麻钩藤饮5.7、11.4、22.8g/kg含药血清组细胞活力显著增加,LDH释放率减少,凋亡细胞量减少,Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表达水平降低,而Bcl-2蛋白表达升高,Caspase-3及Caspase-9活性降低;而10%的天麻钩藤饮2.85g/kg含药血清组无明显变化。结论:天麻钩藤饮含药血清对MPP+诱导的PC12细胞的凋亡具有保护作用,其机制可能与调节线粒体功能密切相关。     

阿魏酸钠对氧糖剥夺所致星形胶质细胞损伤的保护作用及机制研究

目的:观察阿魏酸钠对氧糖剥夺所致的体外培养星形胶质细胞损伤的保护作用,并探讨其机制。方法:原代培养星形胶质细胞分为对照组、氧糖剥夺组、氧糖剥夺+阿魏酸钠组(50,100,200 mol/L)、P38MAPK通路抑制剂SB203580组、氧糖剥夺+SB203580组。阿魏酸钠组细胞在氧糖剥夺前加入不同浓度的阿魏酸钠作用24 h,p38MAPK特异性阻断剂SB 203580(20μmol/L)在氧糖剥夺前1 h加入。将各氧糖剥夺组星形胶质细胞在无糖DMEM培养基、1%O2的培养条件下进行6 h时长的氧糖剥夺,进行如下实验:(1)倒置相差显微镜下观察星形胶质细胞形态学改变。(2)用乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、MTT法检测星形胶质细胞的损伤情况及细胞活力。(3)Hoechst 33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变。(4)Western blot方法观察磷酸化P38和活化的caspase-3蛋白表达的改变。结果:离体培养的星形胶质细胞经过氧糖剥夺处理6 h,细胞发生肿胀,突触回缩,呈空泡样改变,细胞活力明显下降,LDH漏出率增加,凋亡细胞百分比较正常对照组明显增加,SB203580可逆转以上改变。Western blot结果显示,磷酸化P38MAPK和活化的caspase-3蛋白表达也明显增加。氧糖剥夺前24 h加入阿魏酸钠(50,100,200μmol/L)可不同程度逆转以上改变。结论:阿魏酸钠能明显抑制氧糖剥夺所致的体外培养星形胶质细胞的损伤,这种作用与其抑制p38 MAPK信号转导通路有关。     

子宫内膜异位症患者子宫内膜HIF-1α、CD34、CD54的表达及相互关系

目的观察缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、CD34、CD54与子宫内膜异位症(EMS)发生的关系,以期探讨EMS的发病机制。方法选取26例EMS手术患者,所有病例均经腹腔镜或开腹手术确诊,经病理证实为腹膜型EMS 8例,卵巢子宫内膜异位囊肿9例,子宫腺肌症9例,同期选取子宫肌瘤手术患者6例为对照组,应用免疫组织化学法(SP)测定2组子宫内膜组织中HIF-1α、CD34、CD54的表达。结果 HIF-1α、CD34、CD54在腹膜型EMS组、卵巢子宫内膜异位囊肿组、子宫腺肌症组的表达均高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。HIF-1α与CD34、CD54的表达呈正相关。结论 HIF-1α可能在EMS异位病灶形成中起重要作用,推测内异症的发生与局部病灶缺氧有关。且HIF-1α与CD34的表达呈正相关,提示HIF-1α可以促进内异症组织血管生成;HIF-1α与CD54的表达呈正相关,推测HIF-1α可加强异位内膜细胞的黏附作用,从而有利于形成异位灶。     

参芎葡萄糖注射液对H2O2诱导的HUVEC细胞氧化损伤的保护作用

目的:探讨参芎葡萄糖注射液(Shenxiong glucose injection,SGI)对H_2O_2诱导的人脐静脉上皮细胞(HUVEC)细胞氧化模型损伤的保护作用及其机制。方法:体外培养HUVEC人脐静脉内皮细胞,用H_2O_2(130 mmol·L~(-1))处理0.5 h,建立HUVEC细胞H_2O_2氧化损伤模型。SGI组HUVEC细胞用(6%,8%,10%)SGI预处理6 h后,再用H_2O_2处理0.5 h。用MTS法检测细胞存活率;用ELISA法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力;用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测凋亡相关基因及蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的mRNA和蛋白表达情况。结果:在130 mmol·L~(-1)H_2O_2作用细胞0.5 h的情况下,细胞存活率降低至50%左右,降低的程度合适,且实验结果重复性好,因此后续实验用该条件建立氧化损伤模型。与H_2O_2组比较,SGI预处理6 h能显著升高细胞存活率(P0.05,P0.01),减少LDH的外漏和MDA的生成(P0.05,P0.01),显著增加SOD,GSH-Px和CAT的活性(P0.05,P0.01)。RT-PCR和Western blot结果表明,SGI能显著上调Bcl-2的表达(P0.05,P0.01),下调Caspase-3,Bax的表达(P0.05,P0.01)。结论:参芎葡萄糖注射液能保护HUVEC细胞对抗H_2O_2诱导的氧化损伤,具有一定的剂量依赖关系,其作用机制可能与抑制细胞凋亡有关。     

乌头赤石脂汤对老年缺血性心肌病伴心力衰竭患者血清TNF-α,BNP及Hcy水平的影响

目的:探讨乌头赤石脂汤对老年缺血性心肌病伴心力衰竭患者血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),B型钠尿肽(B-type natriuretic peptide,BNP)及同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平的影响。方法:取郑州市中医院治疗的缺血性心肌病心力衰竭老年患者94例,按随机数字表法分为治疗组和对照组,对照组(47例)予以基础治疗,治疗组(47例)在基础治疗上联用乌头赤石脂汤治疗,观察并记录心室重构及心功能、血清指标、生活质量等指标,同时观察临床疗效及不良反应。结果:治疗后对照组治疗有效率(74.47%)低于治疗组(91.49%)(P0.05);与治疗前比较,两组治疗后心室重构及心功能、血清指标、生活质量均发生变化,治疗组治疗后左心室舒张末内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD),左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)指标低于对照组(P0.05),左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF),每分钟输出量(output per minute,CO)指标高于对照组(P0.05),治疗组治疗后血清BNP,肌钙蛋白I(Troponin I,c Tn I),高敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP),TNF-α,Hcy水平低于对照组(P0.05),治疗组治疗后生活质量改善程度优于对照组(P0.05);两组治疗期间无严重不良反应发生。结论:采用乌头赤石脂汤对老年缺血性心肌病伴心力衰竭疗效确切,能降低血清TNF-α,BNP及Hcy水平,提高生活质量。     

加味泽泻汤对NAFLD大鼠肝脏炎症信号通路相关蛋白表达的影响

目的:探讨加味泽泻汤对高脂饮食诱导的大鼠非酒精性脂肪肝(NAFLD)模型的治疗机制。方法:SPF级大鼠分为空白组、模型组、加味泽泻汤组、多烯磷脂酰胆碱组,大鼠分别以10%或45%高脂纯化饲料喂养12周构建NAFLD模型。加味泽泻汤及多烯磷脂酰胆碱治疗组分别给药4周,空白组及模型组则给予相应体积双蒸水4周。以蛋白免疫印迹(Western blot)法检测Toll样受体4(TLR4),髓样分化因子88(My D88),核转录因子-κB p65(NF-κB p65),p38丝裂原活化蛋白酶(p38MAPK),磷酸化的p38丝裂原活化蛋白酶(p-p38),c-Jun氨基末端激酶(JNK),半胱氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)在大鼠肝脏中的表达。结果:与空白组比较,模型组TLR4,My D88,NF-κB p65,p-p65,p38 MAPK,p-p38,JNK及Caspase-1蛋白表达明显增高(P0.05);而加味泽泻汤组相应蛋白的表达量较模型组均显著下降(P0.01)。结论:在高脂饮食诱导的大鼠NAFLD模型中,加味泽泻汤通过抑制TLR4/NF-κB,MAPK信号通路相关蛋白的表达,从而抑制肝脏炎症的产生、缓解肝脏的损伤,达到治疗NAFLD的目的。     

养生益肾汤对早期糖尿病肾病气阴两虚证的防治研究

目的:探讨养生益肾汤对早期糖尿病肾病(DN)气阴两虚证病情延缓作用及对血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α),转化生长因子-β(TGF-β),血小板源生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)水平的影响。方法:170例患者区组随机化按数字表法分为西医组和中西医结合组各85例。西医组给予生活方式指导;控制血糖和降压,纠正脂质代谢紊乱;厄贝沙坦片,1片/d,内服。中西医结合组在西医组治疗的基础上加用养生益肾汤,1剂/d。两组疗程均为6个月,并进行18个月随访。记录24个月内由DNⅢ期发展为DNⅣ期和肌酐(SCr)升高1倍等终点事件的发生情况;检测尿白蛋白排泄率(UAER),血肌酐(SCr),空腹血糖(FBG),糖化血红蛋白(Hb Alc),血脂包括胆固醇(TC),甘油三酯(TG),高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)检测和尿微量白蛋白与肌酐的比值(ACR)等指标,进行气阴两虚证评分,检测治疗前后TNF-α,TGF-β,PDGF和VEGF水平。结果:经Ridit分析,中西医结合组患者的临床疗效优于西医组(P0.05);中西医结合组终点事件的发生率为7.41%,低于西医组的19.51%(χ2=5.113,P0.05);在治疗后3个月时,中西医结合组ACR较治疗前下降,并低于同期西医组水平(P0.05);在治疗后6个月时,中西医结合组UAER,SCr,ACR,Hb Alc,LDL-C均低于同期西医组水平(P0.05),HDL-C则高于同期西医组水平(P0.05);中西医结合组在治疗后3个月和6个月时气阴两虚证评分均低于西医组(P0.05);治疗后中西医结合组后TNF-α,TGF-β,PDGF和VEGF水平均低于西医组(P0.01)。结论:采用养生益肾汤配合西医常规干预方法对早期DN进行防治,能保护患者的肾功能,对DN病情起到延缓作用,降低终点事件的发生率,其作用机制可能与下调TNF-α,TGF-β,PDGF和VEGF等细胞炎症因子水平有关。     

独活寄生汤对风寒湿痹型关节炎患者关节液中炎症因子、氧化应激及脂肪细胞因子的影响

目的:观察独活寄生汤对风寒湿痹型关节炎患者的疗效,并探讨其对关节液中炎症因子、氧化应激及脂肪细胞因子的影响。方法:选取东莞市中医院诊断及治疗的风寒湿痹型关节炎患者124例,按随机数字表法分组,对照组(62例)予以常规治疗,观察组(62例)在对照组基础上予以独活寄生汤治疗,观察并记录两组患者临床症状评分、关节液指标及脂肪细胞因子水平,同时比较两组患者临床疗效及并发症状况。结果:对照组治疗有效率低于观察组(P0.05);与治疗前比较,两组患者治疗后视觉模拟评分法(visual analogue scale,VAS),西安大略和麦克马斯特骨关节炎调查量表(Western Ontario and Mc Master Universities Osteoarthritis,WOMAC)评分均降低,Lyshom评分升高,关节液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factoralpha,TNF-α),白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及白细胞介素-1β(interleukine-1 beta,IL-1β)表达水平降低,关节液一氧化氮(nitric oxide,NO),丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平降低,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平升高,脂联素(adiponectin,APN)水平升高,瘦素(leptin)及内脂素(visfatin)水平降低(P0.05);与对照组比较,观察组治疗后VAS,WOMAC量表评分较低,Lyshom评分较高,关节液TNF-α,IL-6及IL-1β水平较低,关节液NO,MDA水平较低,SOD水平较高,APN水平较高,leptin及visfatin水平较低(P0.05)。结论:独活寄生汤能够使关节炎患者受益,可能与其减少关节液中炎症因子表达及抑制氧化应激有关。     

苦参碱抑制Akt信号通路诱导结肠癌SW480细胞凋亡

目的:研究苦参碱对人结肠癌SW480细胞的促凋亡作用及其可能的分子机制。方法:噻唑蓝比色法(MTT)测定苦参碱对SW480细胞株增殖的影响;Hoechst33258染色检测苦参碱对SW480细胞凋亡的影响,流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测苦参碱对SW480细胞中总蛋白激酶B(Akt),磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达的干预作用。结果:苦参碱(0.25,0.5,1.0,1.5,2.0 g·L~(-1))能浓度和时间依赖性地抑制SW480细胞增殖。作用24,48,72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为1.72,1.08,0.67 g·L~(-1),Hochest33258染色和流式细胞术结果显示苦参碱能显著诱导细胞凋亡(P0.01),随着药物质量浓度的提高,细胞凋亡率逐渐上升。Western blot检测显示,SW480细胞加入苦参碱后,胞内总Akt的含量无显著变化,但p-Akt的生成被显著抑制,凋亡抑制性蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax表达增高(P0.05)。结论:苦参碱能够诱导SW480细胞凋亡,该药理作用可能与苦参碱对Akt信号通路的抑制有关。