大鼠缺血脑中差异表达基因的研究

目的:鉴定大鼠脑缺血差异表达基因。 方法: 复制大鼠大脑中动脉栓塞急性脑缺血模型, 采用荧光差异显示RT-PCR法结合反Northern杂交快速鉴定差异表达基因。 结果: 发现差异表达的基因9个, 其中6个已知的序列和3个未知序列;已知基因中上调的是mus musculus ab1-interactor1,homo sapiens CGI-99 protein, tissue inhibitor of metalloproteinase 3,homosapiens nuclear receptor co-repressor,下调的是homo-sapiens nuclear matrix protein p84和coatomer protein complex, subunit gamma 2。 结论: 荧光差异显示法结合反Northern杂交是一种有效的快速鉴定差异表达基因的方法;脑缺血时,缺血侧和非缺血侧存在基因的差异表达。     

热刺激预处理对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用

【目的】热刺激预处理诱导热休克蛋白表达 ,观察它对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡是否具有保护作用。【方法】热刺激处理诱导热休克蛋白产生 ,复极化诱导体外培养的小脑颗粒神经元凋亡 ,FDA荧光染色计算细胞存活率 ,相差显微镜分析细胞形态 ,Hoechst332 5 8染色分析核形态 ,琼脂糖凝胶电泳分析DNA片段 ,Westernblotting检测HSP70 表达。【结果】小脑颗粒神经元在去极化条件 (2 5mmol/LKCl)下生长良好 ,复极化 (5mmol/LKCl )后 2 0h ,相差显微镜下神经元胞体缩小 ,突起断裂。Hoechst 332 5 8染色见核固缩和凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡的典型生化特征—DNA梯状条带。预先对小脑颗粒神经元进行热刺激处理 (4 4℃ )不同时间 (6 0min ,90min)再复极化 ,神经元凋亡数明显减少 ,且随热处理时间延长 ,保护作用增强。Westernblotting结果 :随热刺激 (4 4℃ )处理时间延长 ,HSP70 表达量逐渐增加。【结论】热刺激预处理对复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡具有保护作用。这一保护作用可能涉及HSP70 。     

基因重组蛇毒纤溶因子rFⅡ理化特性及纤溶能力的研究

【目的】研究重组蛇毒纤溶因子的理化特性和纤溶能力。【方法】SDS—PAGE及高效液相法分析重组蛇毒纤溶因子rFII相对分子质量、纯度，等电聚焦分析其等电点；纤维平板和SDS-AGE检测重组蛇毒纤溶因子对纤维蛋白及纤维蛋白原的水解能力。【结果】重组蛇毒纤溶冈子rFII是一个相对分子质量在28000，等电点9．0的碱性蛋白酶。它水解纤维蛋白原的Aα、Bβ、γ亚基，水解能力随时间和浓度的增加而增加。它对纤维蛋白的水解能力比相同浓度下的纤溶酶强4倍。【结论】rFII是一种高效的水解纤维蛋白原和纤维蛋白的碱性蛋白酶。     

氯胺酮预给药对体外谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响

目的探讨氯胺酮预给药对谷氨酸诱导大鼠小脑颗粒神经元(CGNs)凋亡的作用及信号转导机制。方法将原代培养的大鼠CGNs随机分为8组:C组:培养基中不加药液;G组:培养基中加入300 μmol/L谷氨酸;K1、K2、K3组:培养基中分别加入10、100、1 000μmol/L氯胺酮预先孵育1 h 后,再加入谷氨酸;LK3组:培养基中加入20μmol/L Ly294002,30min后加入1 000μmol/L.氯胺酮,1 h后加入谷氨酸;L组:培养基中加入Ly294002;LG组:培养基中加入Ly294002,30 min后加入谷氨酸。20 h后,用相差显微镜观察神经元形态学,Hoechst33258核染色后,观察凋亡CGNs;提取DNA行琼脂糖凝胶电泳分析,二乙酸荧光素染色法测定CGNs的存活率。结果谷氨酸可诱导大鼠CGNs凋亡。CGNs 存活率:与G组比较,C组、K1、K2、K3、L组升高幅度下降(P<0.05),LG组差异无统计学意义;C组与L组比较差异无统计学意义;LK3组低于K3组(P<0.01)。CGNs存活率(Y)与氯胺酮浓度(X)呈线性回归,回归方程为Y=0.202logX 0.2596,r3=0.919(P<0.01)。结论氯胺酮剂量依赖性地抑制谷氨酸诱导大鼠CGNs的凋亡,而PI3-K/AKT信号转导通路可能参与了其抗神经元凋亡作用。     

01 omoucine对小脑颗粒神经元的保护作用

目的 :研究化学合成的蛋白激酶抑制剂Olomoucine对低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡的作用及机制。方法 :体外神经元培养、凝胶电泳和SAPK/JNK分析盒测定JNK(c -Jun氨基末端激酶 )活性。结果 :低钾 (KC15mmol/L)诱导小脑颗粒神经元的具有典型形态学和生化特征的凋亡。但是 ,特异性的细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDKs)抑制剂Olomoucine通过抑制凋亡 ,而促进低钾环境中培养的小脑颗粒神经元的存活 ,且此保护作用具有浓度依赖性。因激活了JNK的活性而升高了c -Jun的磷酸化水平 ,导致培养于低钾环境中的神经元凋亡。但是 ,当小脑颗粒神经元生长在含Olomoucine 5 0 μmmol/L的低钾培养基中 ,c -Jun的磷酸化水平和JNK活性都明显降低。结论 :Olomoucine可能通过抑制JNK的活性 ,降低c -Jun的磷酸化水平而对低钾培养的小脑颗粒神经元具有保护作用     

峰毒肽Mastoparan诱导大鼠小脑颗粒神经元死亡的机制

目的研究峰毒肽ｍａｓｔｏｐａｒａｎ（ＭＰ）通过改变细胞内钙离子浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）诱导大鼠小脑颗粒神经元死亡的机制。方法测定原代培养神经元的存活率；用Ｆｕｒａ－２／ＡＭ荧光比值成像技术测定［Ｃａ２＋］ｉ。结果ＭＰ剂量依赖性地诱导小脑颗粒神经元死亡，并触发［Ｃａ２＋］ｉ升高。移去细胞外钙，或使用电压依赖性Ｃａ２＋通道阻滞剂尼莫地平不能阻断其作用。用ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ预先耗竭１，４，５三磷酸肌醇敏感的胞内Ｃａ２＋库；或用特异性的磷酯酶Ｃ抑制剂Ｕ７３１２２预处理细胞，能显著地抑制ＭＰ的作用。结论ＭＰ可能通过激活ＰＬＣ／ＩＰ３信号传导途径，触发胞内钙库释放Ｃａ２＋而导致小脑颗粒神经元死亡     

中枢神经元凋亡模型的建立及其信号转导

程序性细胞死亡是多细胞机体在发育过程中调控机体正常生理功能的重要机制。日益增多的证据表明，某些中枢神经系统疾病的发生与发展涉及到神经元的程序性死亡。应用体外去极化条件下，原代培养的小脑颗粒神经元，经复极化处理，可以诱导典型的神经元程序性死亡。研究发现，小脑中广泛存在的神经递质谷氨酸和乙酰胆碱，可以通过特异性的受体调节神经元的程序性死亡。从而提示，神经递质在传导神经冲动的同时，也特异性地传导神经元的生存信号。进一步的实验证明，激活不同的Ｇ蛋白（Ｇｓ或Ｇｉ／ｏ）可以阻断或者诱导神经元的程序性死亡，提示Ｇ蛋白在神经元程序性死亡信号的跨膜传导过程中可能发挥双向开关的作用。某些神经系统药物（如苯妥英钠）和神经毒素（如胆红素）引起小脑萎缩的机制也可能与颗粒神经元的程序性死亡有关。     

五步蛇毒纤溶酶FⅡ对LPS诱导的肾纤维蛋白沉积的作用

目的观察五步蛇毒纤溶酶FⅡ对LPS诱导的兔肾纤维蛋白沉积的作用。方法用脂多糖(LPS)诱导的兔肾血栓模型作为本实验的研究方法。生理盐水作阴性对照组;尿激酶作阳性对照组。兔肾组织学检查及测定血浆FDP含量以观察五步蛇毒纤溶酶FⅡ对兔肾纤维蛋白沉积的溶解作用。结果阴性对照组,给药2、6h后,兔肾组织有大量的纤维蛋白的沉积,FDP含量分别为(7821±479)%和(8427±621)%;阳性对照组,给药2、6h后,肾组织有少量纤维蛋白的沉积,FDP含量分别为(13334±427)%和(21017±542)%。FⅡ分别以01mg·kg-1·h-1(低)、03mg·kg-1·h-1(中)、06mg·kg-1·h-1(高)3个剂量滴注。低剂量组的兔肾组织有纤维蛋白的沉积,但比阴性对照组减少;中剂量组的兔肾组织有少量纤维蛋白的沉积;高剂量组的兔肾组织几乎无纤维蛋白的沉积;血浆FDP含量在低、中和高剂量组均比阴性对照组增加,并有量效关系(P<005)。结论步蛇毒纤溶酶FⅡ对LPS诱导的兔肾纤维蛋白沉积有良好的降解作用。     

左归丸加减方对谷氨酸诱导的体外培养大鼠小脑颗粒神经元凋亡影响

目的 :研究左归丸加减方对谷氨酸引起的体外培养的小脑颗粒神经元 (CGNs)兴奋毒性死亡是否有抑制作用及其可能的分子机制。方法 :采用二乙酸荧光素 (PDA)和Hoechst332 5 8DNA染色法 ,观察神经元存活率及形态学特征 ,用琼脂糖凝脉电泳分析神经元死亡的生化特征。结果 :30 0 μmol·L- 1 谷氨酸可引起体外培养的CGNs调亡 ,左归丸加减方水提物 (ZGP)可以剂量依赖地阻断谷氨酸所致的CGNs调亡。PD980 5 9可以阻断谷氨酸的诱导CGNs调亡作用 ,协同ZGP的抗谷氨酸诱导CGNs调亡作用。LY2 94 0 0 2可以阻断ZGP的抗谷氨酸诱导CGNs调亡作用。结论 :ZGP对谷氨酸诱导的体外培养的大鼠CGNs调亡有保护作用 ,PI3 K Akt信号传导通路可能参与其作用。     

大鼠小脑颗粒神经元凋亡相关的差异表达基因ARNT2的克隆

[目的]研究凋亡与非凋亡大鼠小脑颗粒神经元(cerebellar granule neuron,CGN)细胞中基因表达的差异,克隆出与大鼠CGN凋亡相关的基因.[方法]用荧光差异显示聚合酶链反应(florescent differential display polymerase chain reaction,FDD PCR)从低钾诱导的大鼠CGN凋亡模型中筛选出差异表达序列标签(expressed sequence tag,EST),反向Northern blot杂交进一步验证后,用cDNA 5′末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA 5′Ends,5′RACE)克隆差异表达EST的目标基因,用RT-PCR及Western blot进一步验证目标基因mRNA 及蛋白质水平的表达差异.[结果]用FDD PCR筛选出5号差异表达EST,经反向Northern blot验证后,用5′RACE法成功地克隆到5号EST完整开放阅码框,序列同源性分析证实为大鼠基因ARNT2,RT-PCR及Western blot证实低钾诱导后ARNT2mRNA与蛋白质水平的表达均显著地上调,统计学分析显示差异有显著性(P<0.001).[结论]ARNT2在低钾诱导的大鼠凋亡CGN中表达上调,提示ARNT2与CGN凋亡相关并在该过程中发挥重要作用.