YZ-2蛋白的生物信息学分析及其多克隆抗体制备

目的:生物信息学分析与脑缺氧密切相关的新蛋白质YZ-2,以及制备其多克隆抗体。方法:根据生物信息学分析预测出YZ-2蛋白质的二级结构、亲水性、抗原性等理化特性,以这些分析预测为依据,经过同源性检索后设计出一段由22个氨基酸组成的多肽,免疫家兔得到多克隆抗体,并用ELISA、Westernblot等方法鉴定其特异性和滴度。结果:①成功分析预测其抗原性和亲水性;②制备了抗YZ-2蛋白多克隆抗体;③以此多克隆抗体经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹,检测YZ-2蛋白的表达,证实此抗体效价较高、特异性强。结论:利用生物信息学较好地预测出YZ-2的亲水性和抗原性,并成功制备了其较高特异性的多克隆抗体。     

小脑颗粒神经元低钾性凋亡过程中Arnt2核浆转位的分析

目的：分析大鼠小脑颗粒神经元 (CGNs) “低钾”性凋亡过程中Arnt2亚细胞定位的变化。方法：Western blotting法分析“低钾”性凋亡过程中CGNs 核抽提物中Arnt2蛋白质的表达变化，间接免疫荧光结合激光扫描共聚焦显微术 (LSM) 分析Arnt2蛋白质亚细胞定位的变化。结果：在CGNs细胞核抽提物中，“低钾”诱导30 min后Arnt2 蛋白质已明显表达上调，1 h后达至峰值水平，“低钾”诱导6 h后上调表达的Arnt2回落至正常对照水平；LSM分析显示位于正常CGNs 细胞核内的Arnt2在“低钾”作用下逐步向胞浆转移，并在CGNs凋亡末期与胞浆线粒体定位的HSP60完全重叠。结论：Arnt2在小脑颗粒神经元“低钾”性凋亡过程中发生了核浆转位；结果提示，Arnt2很可能是通过传递“低钾”诱发的细胞凋亡或存活信号而直接参与小脑颗粒神经元“低钾”性凋亡的调控。     

应用mRNA差异显示技术筛选大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达基因

目的： 应用mRNA差异显示技术对大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达基因进行筛选，克隆以及鉴定。方法: 大鼠小脑颗粒神经元的分离和原代培养；对大鼠小脑颗粒神经元凋亡逆转模型进行荧光mRNA差异显示逆转录PCR（FDDRT-PCR,fluorescent differential display RT-PCR）；EST片段亚克隆入pGEM-T EasyTM，克隆后测序并进行序列同源性检索；反Northern杂交重鉴定与筛选。结果: 通过DDRT-PCR获得164 个在小脑颗粒神经元凋亡模型中差异表达的ESTs；对其中的17个ESTs进行了克隆并测序；通过反Northern杂交的初步筛选初步鉴定出5个阳性片段。结论: 阳性差异表达EST的筛选、克隆以及鉴定为神经元凋亡与保护分子机制研究奠定基础。     

胆红素对原代培养不同类型大鼠神经元的毒性作用

目的　观察胆红素对大鼠不同类型神经元的毒性作用及机制。　方法　采用原代培养的大鼠小脑颗粒神经元、皮质神经元及海马神经元 ,观察低浓度 (0～ 17.1μm ol/ L)胆红素对其毒性的影响。用二乙酸荧光素染色法测定神经元存活率 ,荧光技术测定细胞内胆红素的含量。　结果　胆红素呈剂量依赖性地诱导小脑颗粒神经元死亡 ,在胆红素浓度为 4.3、8.6及 17.1μm ol/ L 时 ,颗粒神经元的存活率分别为 (5 0 .1± 3.1) %、(18.5± 2 .3) %和 (2 .0± 2 .4) % ;皮质神经元的存活率分别为(90 .7± 7.8) %、(85 .3± 5 .3) %和 (74.5± 2 .4) % ;海马神经元的存活率分别为 (75± 6 ) %、(6 2± 5 ) %和 (4 9± 5 ) %。胆红素对大脑皮质神经元及海马神经元的毒性明显低于颗粒神经元。加入胆红素 3h后 ,颗粒神经元、皮质及海马神经元细胞内胆红素的荧光强度分别为 33.4± 2 .3、10 .7± 3.0、2 1.9±4.3,小脑颗粒神经元内胆红素含量明显高于海马及皮质神经元 (P<0 .0 1)。　结论　小脑颗粒神经元较海马及皮质神经元对胆红素的毒性敏感 ,与细胞内胆红素含量不同有关     

3-异丁基-1-甲基黄嘌呤对低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的Ca2+/cAMP不依赖性保护作用

 目的观察3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-Isobutyl-1-methylxanthine, IBMX）对5 mmol·L^-1KCl诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的拮抗作用并探讨其与[cAMP]i 和Ca²⁺的关系。方法建立KCl 5 mmol·L^-1诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型,用荧光二酯素法分析神经元存活,Hoechest 33258核染色和DNA琼脂糖凝胶电泳分析凋亡,放射免疫法测定cAMP浓度。结果IBMX呈浓度依赖性拮抗5mmol·L^-1KCl诱导的神经元死亡,并明显减少核形态异常的神经元,使DNA电泳梯带变浅或完全消失;IBMX（1.0 mmol·L^-1）可持续升高神经元[cAMP]i,福司可林2.0μmol·L^-1升高[cAMP]i作用 与IBMX类似,但不能模拟IBMX的作用;此外,IBMX的拮抗作用不被cAMP 竞争性抑制剂Rp-cAMP和PKA的特异阻断药H-89阻断;单用或联用钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ的特异抑制剂KN-93和磷酯酰肌醇3位羟基激酶的特异性抑制剂LY294002也不能阻断。结论IBMX抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡作用不依赖cAMP和Ca²⁺。     

3-异丁基-1-甲基黄嘌呤对低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的Ca~(2 )/cAMP不依赖性保护作用

目的　观察 3 异丁基 1 甲基黄嘌呤 ( 3 Isobutyl 1 methylxanthine ,IBMX)对 5mmol·L-1KCl诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的拮抗作用并探讨其与 [cAMP]i和Ca2 的关系。方法　建立KCl 5mmol·L-1诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡模型 ,用荧光二酯素法分析神经元存活 ,Hoechest332 5 8核染色和DNA琼脂糖凝胶电泳分析凋亡 ,放射免疫法测定cAMP浓度。结果　IBMX呈浓度依赖性拮抗 5mmol·L-1KCl诱导的神经元死亡 ,并明显减少核形态异常的神经元 ,使DNA电泳梯带变浅或完全消失 ;IBMX( 1.0mmol·L-1)可持续升高神经元 [cAMP]i,福司可林 2 .0 μmol·L-1升高 [cAMP]i作用与IBMX类似 ,但不能模拟IBMX的作用 ;此外 ,IBMX的拮抗作用不被cAMP竞争性抑制剂Rp cAMP和PKA的特异阻断药H 89阻断 ;单用或联用钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ的特异抑制剂KN 93和磷酯酰肌醇 3位羟基激酶的特异性抑制剂LY2 940 0 2也不能阻断。结论IBMX抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡作用不依赖cAMP和Ca2 。     

IGF-1经PI3K/Akt依赖性途径保护苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡

目的　观察胰岛素样生长因子 1 (insulin likegrowfactor 1, IGF 1)对苯妥英(100μmol·L-1 )处理的大鼠小脑颗粒神经元 (cerebellargranularneurons, CGNs)存活率的影响,并探讨其与PI3K/Akt通路的关系。方法　体外培养 8的小脑颗粒神经元,同时给予 100μmol·L-1苯妥英和μmol·L-1 IGF 1, 48h后行凋亡分析,观察IGF 1对苯妥英诱导的小脑颗粒神经元的保护作用;采用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002(50μmol·L-1 )预先与小脑颗粒神经元孵育 30min,再加 1μmol·L-1 IGF 1和 100μmol·L-1苯妥英共孵育 48h,测定神经元存活率,观察IGF 1与PI3KAkt通路的关系;Westernblot法检测苯妥因处理不同时间小脑颗粒神经元内磷酸化Akt水平及总Akt的表达量,并观察IGF 1对磷酸化Akt水平的影响,进一步探讨IGF 1的作用是否经PI3K/Akt通路。结果　①1μmol·L-1 IGF 1可明显抑制 100μmol·L-1苯妥英引起的小脑颗粒神经元的凋亡明显提高小脑颗粒神经元的存活率,使其凋亡特征消失。②PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002可取消IGF 1的保护作用。③苯妥英使小脑颗粒神经元内磷酸化Akt水平明显降低,但不影响总Akt表达量。④IGF 1可明显恢复被苯妥英抑制的磷酸化Akt的水平。结论　IGF 1保护苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡,这种     

RNA干扰技术及其在神经科学中的研究进展

RNAi是一项崭新的分子生物学技术,是外源和内源性双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑制的现象。它既可以阻断特定基因的表达又参与基因表达的调控。在神经科学的研究中,我们利用RNAi技术可以方便快捷地研究脑学习和记忆的机制、信号的传导,建立神经性疾病的动物模型,甚至可以利用它来治疗某些神经性疾病。     

鲤鱼精巢DNA对自然衰老小鼠体内抗氧化酶活性的影响

以自然衰老小鼠为实验对象,采用邻苯三酚自氧化法测定ＳＯＤ活性,紫外分光光度法测定ＣＡＴ活性,愈创木酚法测定ＰＯＤ活性,ＤＴＮＢ直接比色法测定ＧＳＨ－Ｐｘ活性,研究了鲤鱼精巢ＤＮＡ对老龄动物体内抗氧化酶活性的影响。结果表明,鲤鱼精巢ＤＮＡ可明显提高自然衰老小鼠体内抗氧化酶的活性。     

鲤鱼精巢DNA对自然衰老小鼠体内抗氧化酶活性的影响

以自然衰老小鼠为实验对象,采用邻苯三酚自氧化法测定ＳＯＤ活性,紫外分光光度法测定ＣＡＴ活性,愈创木酚法测定ＰＯＤ活性,ＤＴＮＢ直接比色法测定ＧＳＨ－Ｐｘ活性,研究了鲤鱼精巢ＤＮＡ对老龄动物体内抗氧化酶活性的影响。结果表明,鲤鱼精巢ＤＮＡ可明显提高自然衰老小鼠体内抗氧化酶的活性。