肿瘤基质成纤维细胞模型的建立及生物学特性研究

目的建立肿瘤基质成纤维细胞模型并探讨其恶性生物学特性,为研究其恶性转化机制、开发靶向肿瘤基质的抗癌药物提供有价值的细胞模型.方法用小鼠肝癌细胞H22培养上清液诱导小鼠成纤维细胞L929,获得能稳定生长的L929-H22细胞.用光镜、电镜观察其形态改变,MTT法检测其生长情况,免疫细胞化学测定其PCNA、bcl-2、MMP-9、TN表达变化,RT-PCR测定其端粒酶活性,并分析其核型、蛋白合成能力、对常用抗癌药物的反应性及其条件培养基(conditionedmedium,CM)对H22细胞生长的影响.结果L929-H22细胞出现多核和畸形核,染色体众数略有增加.细胞群体倍增时间较亲代细胞缩短(t=2.6541,P＜0.05),分裂指数增高(χ2=4.525,P＜0.05),PCNA、bcl-2、MMP-9、TN表达增强(t≥3.305 5,P＜0.01).端粒酶活性增高(t=-40.416 3,P＜0.001).L929-H22细胞对作用于S期或S期和M期或细胞骨架的抗癌药物较L929敏感(q≥3.015 2,P＜0.05).蛋白质合成能力增强(q=-5.901 1,P＜0.001).其CM促进H22细胞生长.结论L929-H22细胞较亲代细胞增殖快,核型发生变化,存活能力强,功能活跃,表达并分泌促进肿瘤细胞生长与侵袭的因子增强,具有肿瘤基质成纤维细胞的某些特性,可作为开发抗癌药物的理想细胞模型.     

金雀异黄素与5-氟尿嘧啶对SGC-7901细胞的抑制作用

目的研究金雀异黄素（genistein，Gen）与5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）对人胃癌细胞SGC-7901的抑制作用。方法采用MTT法检测Gen和5-FU对SGC-7901细胞的抑制作用，流式细胞术检测细胞周期分布，并在透射电镜下观察细胞超微结构改变。结果Gen和5-Fu单用或联合应用对胃癌SGC-7901细胞的生长均有显著的增殖抑制作用，且呈剂量和时间依赖性。两药联合应用时，当药物效应在0．2～0．8时，具有协同或相加作用（CI≤1）；18．8btmol／L的Gen作用后，62．97％的SGC-7901细胞阻滞在G2／M期；8．84μmol／L的5-FU作用后，63．76％的SGC-7901细胞阻滞在s期；3．06μmol／L的Gen与7．96μmol／L的5-Fu联合应用后，67．46％的SGC-7901细胞阻滞在G0／G1期。Gen和5-FU均可诱导SGC-7901细胞凋亡。结论Gen与5-FU通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡而抑制胃癌细胞的生长，对胃癌细胞的增殖抑制具有协同作用。     

姜黄素对人急性髓性白血病细胞的作用及机理的初步探讨

目的　探讨姜黄素对急性髓性白血病细胞 (HL- 6 0 )增殖和细胞周期的调控及细胞凋亡的影响。方法　采用 MTT法测定姜黄素在不同浓度、不同时间对 HL- 6 0的抑制作用 ;流式细胞仪分析细胞周期分布 ;透射电镜观察细胞的超微结构变化。结果　姜黄素可抑制 HL- 6 0细胞的生长 ,其抑瘤率与药物浓度和作用时间呈依赖关系 ;中效浓度 (IC50 )为 2 4 .8μm ol/ L 时 ,流式细胞仪分析证实姜黄素能使 HL- 6 0细胞聚积在 S期、G2 / M期 ;电镜观察发现姜黄素可使 HL- 6 0细胞超微结构发生改变。结论　姜黄素可干扰 HL- 6 0细胞的周期分布 ,具有抗细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用     

阻断PI3K/Akt信号通路对低氧微环境中BCSCs微球体细胞增殖的影响

目的:探讨LY294002特异性阻断磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信号通路对低氧条件下乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)微球体细胞增殖的影响。方法:通过无血清悬浮培养技术从人乳腺癌MCF-7细胞中筛选BCSCs微球体,应用免疫荧光染色检测BCSCs相关标志物CD44及CD133的表达,MTT法检测不同浓度LY294002处理后BCSCs微球体细胞的增殖情况,RT-PCR法检测BCSCs微球体细胞中缺氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α)mRNA的表达,蛋白质印迹法检测BCSCs微球体细胞中HIF-2α、PI3K和磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)蛋白的表达。结果:筛选获得的微球体细胞高表达BCSCs相关标志物CD44和CD133。LY294002能有效抑制低氧条件下BCSCs微球体细胞的增殖,抑制效应在药物作用后72～96h最为明显(P<0.05)。与低氧组比较,低氧+LY294002组微球体细胞中HIF-2αmRNA及PI3K、p-Akt和HIF-2α蛋白表达水平均明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LY294002通过特异性阻断PI3K/Akt信号通路而有效抑制低氧条件下BCSCs微球体细胞的体外增殖能力。     

DNMT在胃癌中的表达及DNMT抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌的影响

目的: 研究DNA甲基化转移酶(DNMT)各亚型DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L在胃癌与胃黏膜中的表达特点,并分析DNMT抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌和胃黏膜细胞的影响。方法: 免疫组化法对60例胃癌与癌旁组织行5种DNMT表达研究。免疫荧光法和Western免疫印迹法对SGC-7901、MKN-45(胃癌细胞)和GES-1(胃黏膜细胞)行5种DNMT表达研究。噻唑蓝比色法和流式细胞术分析5-氮杂-2’-脱氧胞苷对SGC-7901、MKN-45和GES-1增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果: 胃癌与癌旁组织均有5种DNMT不同程度表达,但胃癌组织DNMT1和DNMT3A表达显著低于癌旁组织(P<0.01),DNMT2和DNMT3L表达也低于癌旁组织(P<0.05),只有DNMT3B在胃癌与癌旁组织中无显著差异(P>0.05)。胃癌细胞(SGC-7901和MKN-45)与胃黏膜细胞(GES-1)亦有部分DNMT表达,除DNMT3B在胃黏膜细胞表达较强外,余DNMT在胃癌与胃黏膜细胞中无显著差异。5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌与胃黏膜细胞的增殖率、周期分布和凋亡率并无显著影响。结论: DNMT在胃癌中表达呈降低趋势,抑制DNMT对胃癌细胞的增殖和凋亡无显著影响。     

2型糖尿病患者CD14CD16单核细胞的水平及其对LPS和IL-15刺激的反应

目的: 研究2型糖尿病(T2DM)患者外周血CD14⁺CD16⁺单核细胞的比例及脂多糖(LPS)联合白细胞介素 15(IL-15)对其的影响,以了解炎症性免疫反应在T2DM中的可能作用机制。方法: 对28例T2DM患者和20例健康志愿者外周血用流式细胞术检测CD14⁺CD16⁺单核细胞的比例,并分离其外周血单个核细胞(PBMC),用LPS和IL-15干预4 h,收集PBMC和培养上清。分别采用Western blotting检测PBMC内STAT5和p-STAT5蛋白表达。免疫荧光检测p-STAT5蛋白表达,ELISA法检测外周血25-羟维生素D₃ 和IL-6浓度,免疫比浊法检测其外周血C-反应蛋白(CRP)水平, ELISA法检测LPS和IL-15干预后细胞培养上清IL-6和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的浓度。结果: T2DM组外周血CD14⁺CD16⁺单核细胞数量明显高于正常对照组(P<0.01),并与血清CRP和IL-6水平呈正相关(r=0.394,P<0.05和r=0.741,P<0.01),与25(OH)D₃浓度呈负相关(r=0.409,P<0.01),且25(OH)D₃水平与CRP和IL-6水平均呈负相关(r=-0.479和r=-0.774,均P<0.01),LPS联合IL-15刺激后PBMC的p-STAT5蛋白表达水平和PBMC培养上清IL-6、MCP-1浓度明显高于正常对照组(P<0.01),且T2DM患者p-STAT5的表达存在激活现象。结论: T2DM患者体内存在单核细胞功能紊乱,这种功能紊乱可能与活性维生素D₃不足有关,二者可能参与了T2DM患者体内免疫炎症反应并与微炎症互为因果,从而导致了T2DM及其并发症的发生发展;其作用机制可能与STAT5信号通路的激活有关。     

姜黄素联合木黄酮对人胰腺癌细胞株BXPC-3的作用

目的　体外观察姜黄素及木黄酮对人胰腺癌细胞株 ( BXPC- 3)增殖的抑制作用及两者联合应用时的抑制率及相互作用。方法　采用 MTT法测定两者对人胰腺癌细胞株 ( BXPC- 3)的增殖抑制率 ,利用中效原理判定两药合用的效果。结果　两种药单独应用时随着药物剂量增加 ,其效应也增加 ,它们的相关系数分别为 0 .95 3和0 .998,姜黄素的中效浓度为 2 89.16 μm ol/L,木黄酮的中效浓度为 10 7.5 5 μmol/L;两药合用时它们的相关系数为0 .987,中效浓度为 2 2 5 .2 0 ( 171.6 0 + 5 3.6 0 ) μm ol/L。大剂量 (大于中效剂量 )合用时是协同作用 ( CI<1) ,小剂量(小于中效剂量 )合用时是拮抗作用 ( CI>1)。结论　姜黄素联合木黄酮对人胰腺癌细胞株 BXPC- 3的生长有抑制作用 ,它们合用时大剂量是协同 ,而小剂量则拮抗     

奥沙利铂抗人结肠癌细胞株HT29增殖及其机制的研究

目的 观察抗肿瘤药物奥沙利铂对人结肠癌细胞株HT29体外增殖的影响,初步探讨其作用机制.方法 采用人结肠癌细胞株HT29作为研究对象,MTT法检测不同浓度和作用时间的奥沙利铂对细胞增殖的抑制作用;透射电镜观察细胞形态和超微结构的改变;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡的情况;免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白及凋亡相关基因蛋白的表达.结果 奥沙利铂对HT29细胞的增殖有抑制作用而且呈剂量和时间依赖性.奥沙利铂作用72 h后,电镜可见凋亡细胞及凋亡小体;流式细胞仪检测发现细胞阻滞于G2/M期,G0/G1、S期细胞减少及出现凋亡峰;免疫细胞化学显示Bax和Fas表达增强,CyclinB1、Bcl-2、PCNA表达减弱.结论 奥沙利铂对HT29结肠癌细胞的增殖有抑制作用,其作用机制与细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡有关.     

肿瘤成纤维细胞促进血管形成能力的研究

目的 探讨成纤维细胞在肿瘤血管形成中的作用。方法 对肿瘤成纤维细胞模型L_(929)—H_(22)细胞,用免疫细胞化学测定其促进血管形成因子的表达、双室联合培养测定其促进内皮细胞形成管型的能力与促进肿瘤细胞侵袭的能力,分析其粘贴能力、条件培养基(CM)对H_(22)细胞生长的影响,并与其亲代细胞L_(929)比较。结果 与L_(929)细胞相比,L_(929)—H_(22)细胞粘贴能力增强(F≥104.32,P<0.001);表达血管形成因子基质金属蛋白酶9(MMP—9)、转化生长因子β_1(TGF-β_1)、细胞粘合素(TN)、bcl—2增强(t≥3.305 5,P<0.01);更能促进肿瘤细胞侵袭(F=266.30,P<0.001)与ECV304细胞形成管型(q≥3.2289,P<0.01)。其CM对H22细胞生长有一定的促进作用(F=19.41,P<0.05)。结论 肿瘤成纤维细胞表达血管形成因子增强,在肿瘤侵袭与血管形成中有一定作用。