人表皮生长因子受体显性负性突变体诱导胃癌细胞发生G0/G1期阻滞

 目的：探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体（dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR）对胃癌细胞细胞周期的影响及其分子机制。方法：选用2株人胃癌细胞,分为如下6组：SGC-7901细胞未转染组（US组）、SGC-7901细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组)、SGC-7901细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组)、NCI-N87细胞未转染组（UN组)、NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(EN组)和NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DN组)。采用流式细胞术检测细胞周期,Western blotting检测细胞周期素依赖性蛋白激酶2（CDK2）、cyclin D1、Ser9位点磷酸化糖原合成酶激酶3β［p-GSK-3β(Ser9)］、p21和p27蛋白水平。结果：转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现G0/G1期阻滞,CDK2、cyclin D1和p-GSK-3β（Ser9）蛋白水平降低,p21和p27蛋白水平则升高。结论：DNEGFR通过激活GSK-3β使cyclin D1蛋白水平降低,并降低CDK2蛋白水平,上调p21和p27蛋白水平,最终导致胃癌细胞发生G0/G1期阻滞。这一结果将为胃癌生物治疗研究提供新思路。     

姜黄素逆转人结肠癌细胞株HCT-8/VCR多药耐药的研究

目的探讨姜黄素对人结肠癌耐药细胞株HCT-8/VCR多药耐药性的逆转作用及可能机制。方法运用MTT法进行药敏试验,流式细胞仪检测细胞内罗丹明123(Rh123)的表达,RT-PCR法检测多药耐药基因mdr1 mR-NA水平的变化,Western blot法检测mdr1基因蛋白产物P糖蛋白(P-gp)表达水平的变化。结果经25μmol/L姜黄素处理后,增强了HCT-8/VCR细胞对VCR的敏感性,其逆转倍数为4.58倍,增加了细胞内Rh123的蓄积(P<0.05),明显抑制了多药耐药基因mdr1 mRNA及其蛋白的表达(P<0.05)。结论本研究结果提示姜黄素能抑制耐药基因的表达及功能,提高细胞对化疗药物的敏感性,从而逆转结肠癌细胞的多药耐药性。     

整合素β4表达对甲状腺滤泡癌转移潜能的意义

目的 探讨整合素β4表达对人甲状腺滤泡癌细胞侵袭能力的影响.方法 以人甲状腺滤泡癌细胞系CGTHW-1(具有转移性能)为研究对象,利用肿瘤细胞穿透人工基底膜能力的差异筛选出高、低转移潜能的甲状腺滤泡癌细胞系.采用免疫细胞化学、Western印迹和半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测整合素β4在不同转移潜能甲状腺滤泡癌细胞中的表达情况.结果 高转移潜能甲状腺滤泡癌细胞中整合素β4在mRNA和蛋白的表达均显著升高[0.277 5±0.034 0对0.187 5±0.022 2(免疫组织化学)、0.099 7±0.018 5对0.039 0±0.010 2(Western印迹)、0.555 0±0.101 2对0.270 0±0.029 9(RT-PCR),均P＜0.01].结论 整合素β4在人甲状腺滤泡癌侵袭过程中发挥有重要作用,可能成为抑制甲状腺癌转移的靶向分子.     

二硫代氨基甲酸吡咯烷联合苦参碱对人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 探讨二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)抑制核因子-κ B(NF-κ B)活化后对苦参碱抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长的影响.方法 建立人肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为对照组(灭菌等渗盐水)、苦参碱组(35 mg/kg)、PDTC组(120 mg/kg)和PDTC(120 mg/kg)+苦参碱(35 mg/kg)联合组,腹腔注射用药.绘制肿瘤生长曲线,测定肿瘤生长抑制率;TdT介导的dUTP缺口末端标记法检测肿瘤细胞凋亡情况;电泳迁移率变动分析法检测细胞核内NF-κB的活化水平;免疫组织化学法检测肿瘤组织bcl-2和bax蛋白表达水平;RT-PCR法检测肿瘤细胞NF-κB、bcl-2和bax的mRNA表达水平.多组间比较用SNK-q检验,单独效应比较采用LSD法,相关分析采用Pearson法进行分析.结果 PDTC增强了苦参碱对肿瘤增殖的抑制作用(P＜0.05);苦参碱在诱导肿瘤细胞凋亡的同时激活NF-κB;PDTC能显著抑制苦参碱诱导的NF-κB活化,NF-κB活性的灰度值由93.64±2.95降至65.78±5.65(F=124.754,P＜0.01),同时促进苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡,细胞凋亡指数由55.9%±2.8%升高至74.3%±4.8%(P＜0.05).NF-κB的mRNA表达水平与bcl-2的mRNA表达水平呈正相关(r=0.983,P＜0.01).结论苦参碱诱导皮下移植瘤细胞凋亡的同时激活NF-κB;PDTC可通过抑制NF-κB的活化而下调bcl-2的表达,改变bcl-2与bax的比值,增强苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡的作用.

Abstract：

Objective To investigate the relationship between activation of nuclear factor-κ-gene binding (NF-κ B) and apoptosis induced by matrine(MT) in transplanted tumor of human hepatocellular carcinoma in nude mouse. Methods Tumors were established by injection of hepatocellular carcinoma cell line HepG2 into the back of nude mice. The mice were divided randomly into four groups: Control group, MT group (35 mg/kg), PDTC group (120 mg/kg) and Combination group: PDTC+MT group (120 mg/kg+35 mg/kg), the reagents were injected peritoneally. The tumor growth curve of nude mice bearing transplanted tumor were observed and the inhibition ratios were evaluated. Apoptosis of carcinoma cells was analyzed by TUNEL. The DNA-bingding activity of NF-κ B was determined by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Expression of bcl-2 and bax in carcinoma tissue were detected by immunohistochemical method.NF-κ B mRNA, bcl-2 mRNA and bax mRNA in carcinoma tissue were detected by RT-PCR. Results Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) could enhance the inhibition of matrine on carcinoma proliferation (P＜0.05). The apoptosis and activation of NF-κB in carcinoma cells could be induced by matrine. PDTC significantly suppressed NF-κ B activation induced by matrine in carcinoma cells from 93.64±2.95 to 65.78±5.65 (F=124.754, P＜0.01). Meanwhile, PDTC increased the apoptosis induced by matrine from 55.9%±2.8%to 74.3%±4.8% (P＜0.05).A positive correlation observed between the expressions of NF-κ B and of bcl2 (Pearson correlation coefficient=0.983,P＜0.01). Conclusions Matrine could induce apoptosis and activation of NF-κ B in transplanted tumor. PDTC could increase apoptosis in hepatocellular carcinoma cells might be due to the suppression of NF-κ B activation and the enhancement of bcl-2 expression.     

解聚复肾宁对大鼠肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响

目的:探讨解聚复肾宁(黄芪、地黄、黄连、丹参、姜黄、葛根等)(JJFSN)治疗早期糖尿病肾病(DN)的作用机制。方法:高糖诱导系膜细胞(MC)增殖以及细胞外基质(ECM)分泌,制备不同浓度JJFSN含药血清作用于体外培养的MC,用MTT法检测细胞增殖,放射免疫技术(RIA)检测细胞培养上清中Ⅳ型胶原(ColⅣ)及层黏连蛋白(Ln)的含量。结果:JJFSN含药血清可抑制高糖诱导的MC过度增殖(P0.05),并且这种作用具有药物剂量和时间依赖关系。同时,JJFSN可逆转高糖对ColⅣ和Ln分泌的影响,降低MC培养上清中ColⅣ和Ln的含量(P0.05),并且这种作用随着JJFSN剂量的增加而增强。结论:JJFSN抑制高糖诱导的MC过度增殖并减少ECM的过量分泌,可能是其防治DN早期的作用机制。     

阻断PI3K/Akt信号通路对低氧微环境中BCSCs微球体细胞增殖的影响

目的:探讨LY294002特异性阻断磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信号通路对低氧条件下乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells,BCSCs)微球体细胞增殖的影响。方法:通过无血清悬浮培养技术从人乳腺癌MCF-7细胞中筛选BCSCs微球体,应用免疫荧光染色检测BCSCs相关标志物CD44及CD133的表达,MTT法检测不同浓度LY294002处理后BCSCs微球体细胞的增殖情况,RT-PCR法检测BCSCs微球体细胞中缺氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2α,HIF-2α)mRNA的表达,蛋白质印迹法检测BCSCs微球体细胞中HIF-2α、PI3K和磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)蛋白的表达。结果:筛选获得的微球体细胞高表达BCSCs相关标志物CD44和CD133。LY294002能有效抑制低氧条件下BCSCs微球体细胞的增殖,抑制效应在药物作用后72～96h最为明显(P<0.05)。与低氧组比较,低氧+LY294002组微球体细胞中HIF-2αmRNA及PI3K、p-Akt和HIF-2α蛋白表达水平均明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LY294002通过特异性阻断PI3K/Akt信号通路而有效抑制低氧条件下BCSCs微球体细胞的体外增殖能力。     

2型糖尿病患者CD14CD16单核细胞的水平及其对LPS和IL-15刺激的反应

目的: 研究2型糖尿病(T2DM)患者外周血CD14⁺CD16⁺单核细胞的比例及脂多糖(LPS)联合白细胞介素 15(IL-15)对其的影响,以了解炎症性免疫反应在T2DM中的可能作用机制。方法: 对28例T2DM患者和20例健康志愿者外周血用流式细胞术检测CD14⁺CD16⁺单核细胞的比例,并分离其外周血单个核细胞(PBMC),用LPS和IL-15干预4 h,收集PBMC和培养上清。分别采用Western blotting检测PBMC内STAT5和p-STAT5蛋白表达。免疫荧光检测p-STAT5蛋白表达,ELISA法检测外周血25-羟维生素D₃ 和IL-6浓度,免疫比浊法检测其外周血C-反应蛋白(CRP)水平, ELISA法检测LPS和IL-15干预后细胞培养上清IL-6和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的浓度。结果: T2DM组外周血CD14⁺CD16⁺单核细胞数量明显高于正常对照组(P<0.01),并与血清CRP和IL-6水平呈正相关(r=0.394,P<0.05和r=0.741,P<0.01),与25(OH)D₃浓度呈负相关(r=0.409,P<0.01),且25(OH)D₃水平与CRP和IL-6水平均呈负相关(r=-0.479和r=-0.774,均P<0.01),LPS联合IL-15刺激后PBMC的p-STAT5蛋白表达水平和PBMC培养上清IL-6、MCP-1浓度明显高于正常对照组(P<0.01),且T2DM患者p-STAT5的表达存在激活现象。结论: T2DM患者体内存在单核细胞功能紊乱,这种功能紊乱可能与活性维生素D₃不足有关,二者可能参与了T2DM患者体内免疫炎症反应并与微炎症互为因果,从而导致了T2DM及其并发症的发生发展;其作用机制可能与STAT5信号通路的激活有关。     

DNMT在胃癌中的表达及DNMT抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌的影响

目的: 研究DNA甲基化转移酶(DNMT)各亚型DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L在胃癌与胃黏膜中的表达特点,并分析DNMT抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌和胃黏膜细胞的影响。方法: 免疫组化法对60例胃癌与癌旁组织行5种DNMT表达研究。免疫荧光法和Western免疫印迹法对SGC-7901、MKN-45(胃癌细胞)和GES-1(胃黏膜细胞)行5种DNMT表达研究。噻唑蓝比色法和流式细胞术分析5-氮杂-2’-脱氧胞苷对SGC-7901、MKN-45和GES-1增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果: 胃癌与癌旁组织均有5种DNMT不同程度表达,但胃癌组织DNMT1和DNMT3A表达显著低于癌旁组织(P<0.01),DNMT2和DNMT3L表达也低于癌旁组织(P<0.05),只有DNMT3B在胃癌与癌旁组织中无显著差异(P>0.05)。胃癌细胞(SGC-7901和MKN-45)与胃黏膜细胞(GES-1)亦有部分DNMT表达,除DNMT3B在胃黏膜细胞表达较强外,余DNMT在胃癌与胃黏膜细胞中无显著差异。5-氮杂-2’-脱氧胞苷对胃癌与胃黏膜细胞的增殖率、周期分布和凋亡率并无显著影响。结论: DNMT在胃癌中表达呈降低趋势,抑制DNMT对胃癌细胞的增殖和凋亡无显著影响。     

肿瘤基质成纤维细胞模型的建立及生物学特性研究

目的建立肿瘤基质成纤维细胞模型并探讨其恶性生物学特性,为研究其恶性转化机制、开发靶向肿瘤基质的抗癌药物提供有价值的细胞模型.方法用小鼠肝癌细胞H22培养上清液诱导小鼠成纤维细胞L929,获得能稳定生长的L929-H22细胞.用光镜、电镜观察其形态改变,MTT法检测其生长情况,免疫细胞化学测定其PCNA、bcl-2、MMP-9、TN表达变化,RT-PCR测定其端粒酶活性,并分析其核型、蛋白合成能力、对常用抗癌药物的反应性及其条件培养基(conditionedmedium,CM)对H22细胞生长的影响.结果L929-H22细胞出现多核和畸形核,染色体众数略有增加.细胞群体倍增时间较亲代细胞缩短(t=2.6541,P＜0.05),分裂指数增高(χ2=4.525,P＜0.05),PCNA、bcl-2、MMP-9、TN表达增强(t≥3.305 5,P＜0.01).端粒酶活性增高(t=-40.416 3,P＜0.001).L929-H22细胞对作用于S期或S期和M期或细胞骨架的抗癌药物较L929敏感(q≥3.015 2,P＜0.05).蛋白质合成能力增强(q=-5.901 1,P＜0.001).其CM促进H22细胞生长.结论L929-H22细胞较亲代细胞增殖快,核型发生变化,存活能力强,功能活跃,表达并分泌促进肿瘤细胞生长与侵袭的因子增强,具有肿瘤基质成纤维细胞的某些特性,可作为开发抗癌药物的理想细胞模型.     

肿瘤成纤维细胞促进血管形成能力的研究

目的 探讨成纤维细胞在肿瘤血管形成中的作用。方法 对肿瘤成纤维细胞模型L_(929)—H_(22)细胞,用免疫细胞化学测定其促进血管形成因子的表达、双室联合培养测定其促进内皮细胞形成管型的能力与促进肿瘤细胞侵袭的能力,分析其粘贴能力、条件培养基(CM)对H_(22)细胞生长的影响,并与其亲代细胞L_(929)比较。结果 与L_(929)细胞相比,L_(929)—H_(22)细胞粘贴能力增强(F≥104.32,P<0.001);表达血管形成因子基质金属蛋白酶9(MMP—9)、转化生长因子β_1(TGF-β_1)、细胞粘合素(TN)、bcl—2增强(t≥3.305 5,P<0.01);更能促进肿瘤细胞侵袭(F=266.30,P<0.001)与ECV304细胞形成管型(q≥3.2289,P<0.01)。其CM对H22细胞生长有一定的促进作用(F=19.41,P<0.05)。结论 肿瘤成纤维细胞表达血管形成因子增强,在肿瘤侵袭与血管形成中有一定作用。