VEGFR-2在异常切应力诱导的动脉粥样硬化病变中的表达

目的通过建立异常切应力诱导的兔颈总动脉粥样硬化（As）模型,观察血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）在颈总动脉血管壁的表达分布。方法 26只新西兰兔行右颈总动脉硅胶管套环后,随机分为对照组和高胆固醇组。全自动生物化学分析仪测定兔血浆中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）含量;HE染色观察兔颈总动脉病理组织学改变;免疫组织化学法检测兔颈总动脉血管壁VEGFR-2的表达分布。结果 9周末,高胆固醇组TC、HDLC、LDLC水平高于对照组（P〈0.05）;颈总动脉HE染色显示高胆固醇组套环远心段和近心段有斑块形成,且近心段斑块更加明显,并可见大量泡沫细胞;免疫组织化学显示对照组颈总动脉血管壁内膜有少量VEGFR-2蛋白表达,高胆固醇组套环远心段和近心段内膜VEGFR-2的蛋白表达增多,其中近心段和远心段斑块内也有少量VEGFR-2蛋白表达。结论 VEG-FR-2在异常切应力诱导的兔颈总动脉粥样硬化病变中有表达,其主要分布在套环部位的远心段和近心段。     

肥大细胞对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响

目的　检测大鼠腹腔肥大细胞(mastcell,MC)对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响。方法　SD大鼠体重约2 0 0g ,雌雄不限,供采集MC和原代培养平滑肌细胞(smoothmusclecell,SMC)。采用梯度密度离心分离MC ,提取MC上清液(含MC释放的各种炎症介质)。用MC上清液和氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)处理SMC ,实验分四组:对照组SMC在5mL含10 %小牛血清的DMEM中培养4 8h ;oxLDL组SMC在5mL含10 %小牛血清的DMEM中(含oxLDL ,终浓度为10 0mg L)培养4 8h ;MC上清液组SMC在5mL含10 %小牛血清的MC上清液(由含1×10 6 个MC的细胞悬液提取)中培养4 8h ;MC上清液+ox LDL组SMC在5mL含10 %小牛血清的MC上清液(由含1×10 6 个MC的细胞悬液提取)中(含oxLDL ,终浓度为10 0mg L)培养4 8h。采用油红O染色检测SMC泡沫化。RT PCR检测SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达,PCR引物序列Ⅰ型胶原为5′GACACTGAACCCTTTGTAATG 3′和5′GTGAAACTCCCGTCTGCT 3′,扩增片段长度为399bp ;Ⅲ型胶原引物序列为5′AGCGGAGAATACTGGGTT 3′和5′TGTAATGTTCTGGGAGGC 3′,扩增片段长度为2 88bp ;内参照采用βactin ,引物序列为5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′和5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3′,扩增片段长度为5 4 8bp。免疫细胞化学染色检测SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达。结果　油红O染色显示MC上清液可加速SMC泡沫化。RT PCR结果发现,与对照组SMC相比,用oxLDL或MC上清液分别单独处理SMC 4 8h后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达均降低,用oxLDL和MC上清液同时处理SMC 4 8h后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达降低更明显。免疫细胞化学染色显示,对照组SMC细胞浆内有大量棕色颗粒,颗粒粗大而染色深,说明对照组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达为强阳性;用oxLDL或MC上清液分别单独处理SMC 8h后,细胞浆内棕色颗粒少而染色浅,说明Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达均明显降低;用oxLDL和MC上清液同时处理SMC 4 8h后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达降低更明显。结论　MC在体外抑制SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原表达,并且能协同oxLDL对Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的抑制作用。因此MC释放的炎症介质也许参与了动脉粥样斑块纤维帽的重构。     

SDF-1α基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位

目的构建SDF-1α基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体，进而观察SDF-1α基因编码蛋白在细胞内的定位情况。方法用EcoRI内切酶从pMD-T18一SDF-1α重组载体中酶切分离SDF-1α基因的完整ORF，构建pEGFP-C1-SDF-1α的融合表达载体，脂质体转染COS-7细胞，并在荧光显微镜下观察表达的融合蛋白。结果SDF-1α基因在COS-7细胞中高效表达，激光共聚焦的结果显示，SDF-1α基因定位在细胞质内。结论成功构建了pEGFP-C1-SDF-1α的融合表达载体，SDF-1α基因主要在细胞质中表达。     

脂肪分化相关蛋白通过酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1促进巨噬细胞脂质蓄积

目的观察高表达脂肪分化相关蛋白对酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1表达及脂质蓄积的影响。方法构建表达载体pcDNA3.1-HA-脂肪分化相关蛋白,使用THP-1巨噬细胞,通过瞬时转染使之高表达脂肪分化相关蛋白,依次用氧化型低密度脂蛋白和(或)丙泮尼地处理。逆转录聚合酶链反应和Western blot检测酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1及脂肪分化相关蛋白的表达,油红O染色和高效液相色谱检测细胞内脂质的蓄积。结果随着氧化型低密度脂蛋白浓度的增加,巨噬细胞脂肪分化相关蛋白及酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1表达明显增强,两者呈伴行关系。丙泮尼地能抑制酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1表达上调,且随处理时间延长,其表达逐渐减少,并且能减少细胞内脂滴生成。与对照组相比,瞬时转染pcDNA3.1-HA-脂肪分化相关蛋白能使脂肪分化相关蛋白表达明显升高。高表达脂肪分化相关蛋白的巨噬细胞能使酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1表达增加,促进细胞内胆固醇酯蓄积,并协同增强氧化型低密度脂蛋白的作用。加入丙泮尼地后,高表达脂肪分化相关蛋白的作用被减弱。结论高表达脂肪分化相关蛋白能上调THP-1巨噬细胞酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1表达,促进细胞内脂质蓄积。脂肪分化相关蛋白可能通过酰基辅酶A∶胆固醇酰基转移酶1促进细胞内胆固醇酯的蓄积。     

基质细胞衍生因子1α对大鼠血管平滑肌细胞与单核细胞粘附的影响

目的探讨基质细胞衍生因子1α对大鼠血管平滑肌细胞与单核细胞粘附的影响。方法原代培养的大鼠血管平滑肌细胞与50mg/L氧化型低密度脂蛋白孵育48h,将单核细胞与平滑肌细胞共孵育后洗脱检测粘附功能,并用基质细胞衍生因子1α抗体阻断。结果经氧化型低密度脂蛋白处理的血管平滑肌细胞基质细胞衍生因子1α上调5倍,单核细胞粘附增加29倍,但可被基质细胞衍生因子1α单抗所阻断。结论基质细胞衍生因子1α参与单核细胞与大鼠血管平滑肌细胞的粘附过程。     

氧化型低密度脂蛋白诱导大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒

目的　观察氧化型低密度脂蛋白 (oxLDL)诱导大鼠腹腔肥大细胞 (MC)脱颗粒。方法　SD大鼠体重约 2 0 0g ,雌雄不限 ,供采集MC。采用梯度密度离心分光光度仪检测细胞上清液和细胞裂解液组胺含量 ,计算组胺释放率 ,寻求oxLDL致MC脱颗粒的最佳浓度。用最佳浓度的oxLDL处理MC进行实验 ,将分离提纯的MC于含 10 %小牛血清和 10 0g LoxLDL的DMEM中培养 4 8h。通过倒置显微镜、甲苯胺蓝染色、透射电镜观察肥大细胞脱颗粒状态。结果　oxLDL浓度依次为 0、5 0、10 0及 2 0 0g L时 ,肥大细胞组胺释放率逐渐增高 ,分别为 4 .38%± 1.5 8% ,39.98%± 2 .2 1% ,5 2 .99%± 1.13% ,71.70 %± 3.0 2 %。以 10 0mg LoxLDL处理MC后 ,倒置显微镜观察发现对照组MC多数呈半贴壁生长 ,细胞为球形 ,形态完整 ,边界清晰 ,细胞浆内有大量透亮粗大颗粒 ,有部分细胞贴壁较牢 ,呈梭形 ;处理组MC有较多细胞形态不规则 ,边界不清 ,有颗粒释放到细胞外。甲苯胺蓝染色显示 ,处理组有较多MC脱颗粒 ,细胞膜不完整 ,细胞内颗粒稀疏 ,而细胞周围有数量不等的紫红色颗粒 ;对照组仅有少部分MC脱颗粒 ,细胞呈球形 ,细胞膜完整 ,细胞核染成蓝色 ,细胞浆内有大量紫红色的粗大颗粒 ,颗粒电子密度高 ;处理组MC形态不规则 ,细胞浆内颗粒稀疏 ,多数颗粒     

氧化高密度脂蛋白及其亚型对人脐静脉内皮细胞组织因子途径抑制物-1表达的影响

目的 探讨氧化高密度脂蛋白(oxHDL)及其亚型对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)组织因子途径抑制物-1(TFPI-1)表达的影响.方法 以天然HDL及其亚型作为对照,HUVECs分别经不同浓度(0,10,20,40,80 mg/L)oxHDL、oxHDL2、oxHDL3孵育24 h,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹分别检测TFPI-1 mRNA及蛋白质表达.结果 与对照组比较,oxHDL、oxHDI2、oxHDL3能抑制TFPI-1 mRNA和蛋白表达,其中在oxHDL和oxHDL3各系列浓度中以40 mg/L作用最明显,TFPI-1 mRNA和蛋白表达分别下降了28％、35％和49％、47％;在oxHDL2各系列浓度中以80 mg/L作用最明显,TFPI-1 mRNA和蛋白表达均下降了27％,差异均具有统计学意义(P＜0.05);且以oxHDL3的作用最强.结论 oxHDL及其亚型能抑制HUVECs TFPI-1 mRNA和蛋白表达,oxHDL3的作用最强.     

外源性硫化氢对氧化型低密度脂蛋白诱导组织因子和组织因子途径抑制物表达的影响

目的研究外源性硫化氢对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导内皮细胞组织因子(TF)和组织因子途径抑制物(TFPI)表达的影响。方法培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),分别以不同浓度NaHS(25、50、100及200μmol/L)和50 mg/L ox-LDL共孵育,RT-PCR和ELISA分别检测TF和TFPI mRNA表达和蛋白含量。结果用50mg/L ox-LDL孵育HUVEC 24 h后,TF mRNA表达上调8倍,蛋白含量增加7倍(P<0.01);而TFPI mRNA表达降低73%,蛋白含量减少65%(P<0.01)。用25、50、100及200μmol/L NaHS预孵育HUVEC 1 h,再与ox-LDL共同孵育,与ox-LDL组相比,加入不同浓度NaHS组TF mRNA分别降低12%、31%、63%和80%(P<0.05),蛋白含量分别降低13%、30%、62%和77%;TFPI mRNA表达分别升高0.6、1.2、2.0和2.6倍,蛋白含量分别升高0.3、0.7、1.1和1.6倍。结论 NaHS能抑制ox-LDL对内皮细胞TF表达的诱导作用,减轻ox-LDL对内皮细胞TFPI表达的抑制作用。