YMDD突变株HBV转基因小鼠的制备及检测

目的建立YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供转基因动物模型。方法采用受精卵显微注射法,将带有YMDD突变的对拉米夫定有耐药性的1.3拷贝HBV基因注入FVB/N单细胞受精卵的原核内,制备YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠。采用PCR检测外源基因的整合和传代情况,采用ELISA和免疫组化等方法检测HBsAg在肝、肾中的复制和表达情况。结果注射受精卵3401枚,产269只F0代仔鼠,PCR阳性33只,外源基因的整合率12.3%。9只转基因鼠血清HBVDNA弱阳性,拷贝数低于103拷贝/ml;免疫组化结果显示肝组织和肾组织均有HBsAg表达,且肾组织中的表达强于肝组织。经传代产下47只F1代转基因鼠,目的基因PCR阳性率为27.6%,且肝组织和肾组织中HBsAg均有表达,分布特性与F0代一致。结论成功制备出体内有复制表达而且可以传代YMDD耐药突变株HBV的转基因小鼠。     

丙型肝炎病毒结构基因转基因小鼠模型的建立

目的建立丙型肝炎病毒(HCV)转基因小鼠模型，探讨丙型肝炎发病机制，研究HCV结构蛋白编码基因的功能与致病作用。方法采用长片段聚合酶链反应技术扩增HCV结构基因，构建稳定表达与诱导表达两种真核细胞表达重组体，经体外细胞转染后，将具有表达功能的线性化表达元件采用显微注射法，直接导入1736枚小鼠受精卵，先后移入69只假孕母鼠输卵管。结果妊娠受体25只，产仔105只，成活57只。注射卵成仔率仅3．28％。经聚合酶链反应扩增、测序、酶切及Southern杂交鉴定，获阳性首建鼠26只，注射卵首建鼠成功率仅1．50％。其中稳定表达型10只，诱导表达型16只。经与正常鼠交配，获F1阳性杂合鼠分别38只、20只。一个纯合子品系。结论研究建立了稳定表达与诱导表达两类HCV结构基因转基因小鼠，为进一步研究HCV致病机制，HCV基因功能奠定了基础。     

PC-1转基因小鼠的建立及其与2型糖尿病发病的关系

目的探讨PC-1基因高表达与肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病的关系。方法构建pcDNA3.1/PC-1转基因质粒,经显微注射的方法获得G0代转基因小鼠;用PCR、Southern印迹、RT-PCR和Western印迹方法检测PC-1转基因小鼠的基因组整合和组织表达;对转基因小鼠进行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)。结果测序证明克隆的PC-1cDNA序列与GenBank相应序列相比无误,转基因质粒中PC-1插入方向正确;鼠尾基因组DNA PCR和Southern印迹表明共获得8个PC-1转基因阳性的G0代小鼠,分别与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得5个F1代PC-1转基因小鼠系;RT-PCR、Western印迹证实该基因在2个单系的骨骼肌和肝组织中有稳定表达;与野生型小鼠相比,转基因阳性小鼠的体重、空腹血糖、IPGTT和ITT结果无明显变化。结论成功构建稳定表达PC-1基因的转基因小鼠系,研究结果表明该基因在相关组织中的高表达不足以触发肥胖、胰岛素抵抗或2型糖尿病的发生。     

加味四逆散抑制HBV转基因小鼠HBV实验研究

目的:通过对HBV转基因小鼠(TGM)的实验观察,探讨加味四逆散抗HBV作用.方法:选用G3代HBVTGM22只,非HBVTGM10只,分为3组:正常对照、转基因对照和转基因治疗组,治疗组按50g/kg·d-1灌加味四逆散(约含生药4g/ml),两对照组灌等体积的生理盐水,共30天,采用HBV DNA PCR定量法检测治疗前后HBVTGM血清中HBV DNA含量,斑点杂交法检测TGM肝组织HBV DNA的含量.结果:治疗组小鼠血清中HBVDNA定量比治疗前有显著下降(7.662±0.78比5.22±3.14,P＜0.05),而HBV TGM对照组灌生理盐水前后HBVDNA定量差异不显著(7.125±4.26比8.932±5.12,P＞0.05);治疗组肝细胞中的HBV DNA比对照组斑点的OD值有明显的减少(0.274±0.096比0.432±0.119,P＜0.01).结论:加味四逆散具有一定的抑制HBVTGM血清中与肝组织中HBV DNA的作用.     

骨髓间充质干细胞参与牙髓损伤修复的体内实验研究

目的:观察体内的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)能否参与牙髓损伤的局部修复,初步探讨骨髓间充质干细胞在牙髓损伤修复中的作用。方法:构建绿色荧光蛋白转基因大鼠骨髓间充质干细胞(GFP-BMMSCs)嵌合SD大鼠模型,30 d后,通过流式细胞术检测外周血单核细胞和骨髓间充质干细胞中荧光细胞的比例,冰冻切片观察心、肝、肾组织中是否有荧光细胞的分布,检测模型是否构建成功。然后利用该模型,通过制备牙本质缺损构建牙髓损伤模型,分别于牙本质缺损后5、10、15 d取材,切片,HE及免疫荧光染色,观察牙髓的病理变化以及GFP-BMMSCs在牙髓组织中的分布情况和变化。结果:HE染色可见牙本质缺损组初期有牙髓充血,后期牙髓炎症逐渐恢复并有修复性牙本质形成。免疫荧光染色可见牙髓组织中有荧光细胞的分布,牙本质缺损组比正常组中可见更多的荧光细胞,且随着牙髓炎症的恢复,荧光细胞减少。结论:牙髓损伤时,骨髓间充质干细胞可以迁移到损伤的牙髓处参与其损伤的修复。     

多囊卵巢综合征转基因动物模型的研究进展

多囊卵巢综合征(PCOS)是育龄期妇女常见的生殖内分泌及代谢紊乱性疾病,病因不明.建立合适的动物模型对研究其发病机制、病程发展、临床治疗及并发症的预防有着重要的意义.既往的动物模型为雌、雄激素或灯光控制诱导.近年来,转基因动物模型、基因敲除动物及组织特异性基因敲除动物被广泛应用于PCOS的研究.本综述总结了几种通过基因手段复制的啮齿类PCOS动物模型的来源、特点、研究进展、应用及优缺点,为实验研究选择相应的动物模型提供参考.     

反义锁核酸在转基因小鼠体内阻断乙肝病毒C基因表达

目的 探讨针对乙肝病毒C基因反义锁核酸在转基因小鼠体内阻断病毒基因表达的效果.方法 各实验组经尾静脉给药后,采用real-time PCR、时间分辨免疫荧光技术、免疫组织化学法等技术分别检测血清HBV DNA、HBeAg含量及肝细胞内HBcAg的表达情况.结果 注射锁核酸后,对乙肝病毒核酸的复制和乙肝病毒e抗原的合成均有较强的抑制作用,注射后1、3 和5 d,HBV DNA的平均抑制率分别19.24％、39.20％和44.47％;HBeAg的平均抑制分别为30.71％、51.14％和63.46％;小鼠肝细胞的HBcAg阳性细胞数也较对照组明显减少.结论 针对乙肝病毒C基因的反义锁核酸在转基因小鼠体内能有效抑制病毒基因的复制和表达,提示C基因可作核酸药物治疗的有效靶位.     

MagA转基因小鼠模型的建立

目的建立MagA转基因小鼠,为活体MRI成像系统提供重要的实验动物模型。方法采用显微注射法．将MagA基因导入小鼠受精卵,再培育成转基因小鼠并繁殖传代。利用PCR方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。结果酶切和DNA测序分析证实MagA基因准确克隆表达载体设计位点,目的基因序列与GenBank中MagA序列完全一致。通过PCR分析,进行转基因整合检测。目前转基因小鼠已稳定传代至第5代。结论MagA基因在转基因小鼠中整合,成功建立了MagA转基因小鼠。MagA转基因小鼠将成为MRI影像系统的重要实验动物模型。     

核化线粒体组学与转基因人分析法

二十世纪遗传与基因工程技术的发展为人类从生物化学和遗传学角度探索基因及其产物的分子机制开辟了新途径。然而，现有基因工程技术，特别是转基因技术，因伦理学上的原因并不完全适用于涉及人类自身的生物医学研究。因此，有待新技术与方法的建立以使基因工程策略能更好地用于人类基因组水平的研究。本文提出一种转基因人分析法即以人类染色体DNA与线粒体DNA的重组作为研究对象。我们将这种研究线粒体DNA与染色体DNA的相互作用的科学称之为核化线粒体组学。利用核化线粒体组学方法，一个长度为16kb与人类线粒体参考序列NC-001807具有94％同源性的人类古线粒体已组装完成，其无疑将对现代医学与进化研究具有不可估号的作用。