转录因子Runx2调控前成骨细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子的表达

背景：细胞外基质磷酸化糖蛋白基因在骨的矿化和吸收、成骨细胞与破骨细胞的平衡中起重要的作用,研究细胞外基质磷酸化糖蛋白的功能及其调控机制可为骨质疏松症的治疗提供新的思路。目的：分析转录因子Runx2在小鼠前成骨细胞中对细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子的调控作用,进而初步研究转录因子Runx2在骨形成发育过程中的作用。方法：首先根据Genbank中Runx2的基因序列构建Runx2真核表达载体;然后利用双荧光素酶基因检测报告系统分析Runx2对不同长度的细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子转录活性的影响,以确定Runx2有明显作用的启动子区段,分析3种MAPK信号通路抑制剂调控Runx2对细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子转录活性的影响;最后利用定时定量RT-PCR法分析Runx2对细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子表达活性的影响。结果与结论：成功构建Runx2真核表达载体;双荧光素酶基因检测报告系统分析显示Runx2能够上调细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子在前成骨细胞中的转录活性,在(-300-+66)366 bp片段区域内上调效果较为显著,Runx2可通过激活MEK激酶MAPK通路上调细胞外基质磷酸化糖蛋白启动子活性;定时定量RT-PCR法检测再次验证Runx2上调细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子的表达水平。提示转录因子Runx2可以通过MEK激酶MAPK信号通路对细胞外基质磷酸化糖蛋白基因表达进行调节,为探讨细胞外基质磷酸化糖蛋白在骨形成发育过程中的意义奠定基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

MDR1启动子的活性研究

目的:克隆编码多药耐药基因-1（MDR1）中不同长度的启动子片段并探讨和比较其在乳腺癌细胞中的转录活性。方法: 利用PCR扩增技术以MCF-7/ADR细胞基因组为模板克隆3种不同长度的启动子片段。pGL3-basic的启动区域中,构建一系列报告基因载体pGL3-MDR1Pn。以pGL3-control为阳性对照,分别将含不同长度的MDR1启动子的报告基因载体pGL3-MDR1Pn与pRL-TK以一定比例共转染到敏感的MCF-7细胞和耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞,通过分析表达的荧光素酶的活性从而比较不同长度的启动子片段在这两种细胞中的转录活性。结果:通过酶切鉴定和测序验证了已将不同长度的MDR1启动子片段成功插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,且克隆的片段中没有出现碱基突变。将表达载体转染细胞后活性检测结果显示pGL3-MDR1P1、pGL3-MDR1P2和pGL3-MDR1P3在MCF-7中活性分别为阳性对照的(13.03 2.35)%、(14.60 3.57)%和(10.27 1.89)%;而在MCF-7/ADR中活性分别为阳性对照的(105.26 6.84)%、(59.08 4.95)%和(62.39 5.76)%。结论:成功克隆了MDR1启动子片段,并成功构建了荧光素酶报告基因载体pGL3-MDR1P。启动子的活性分析结果初步表明长度约为2 000 bp的MDR1P1在MCF-7/ADR中具有相对较高的特异性。     

人Bax启动子荧光素酶报告基因的构建和鉴定

[目的]克隆人Bax基因的启动子,插入荧光素酶报告基因载体中,并在细胞内检测其活性。[方法]采用PCR技术从人HepG2细胞中扩增出Bax启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,经测序确定所扩增的DNA序列,并将其转染入H1299细胞中检测其活性。[结果]测序结果表明扩增的Bax启动子序列正确,双报告基因实验检测荧光素酶活力表明构建的报告基因具有启动子活性。[结论]克隆了Bax启动子,成功构建了人Bax启动子报告基因,为p53家族凋亡通路的功能研究提供了必要的实验材料。     

CRX基因突变影响视紫红质转录表达和NRL蛋白稳定性的细胞学研究

目的在细胞水平上,探讨存在和缺乏神经视网膜亮氨酸拉链（NRL）的条件下,视锥-视杆细胞同源异形框基因（CRX）突变型对调控视紫红质基因转录表达的影响,并分析CRX突变型对CRX和NRL蛋白稳定性的影响。方法实验研究。分别构建携带野生型和c.C766T（p.Gln256X）无义突变型的CRX基因,以及共表达NRL基因和牛视紫红质基因启动子萤光素酶（pBR130-luc）的表达载体,分别转染体外培养的293T细胞和ARPE-19细胞,再行双荧光素酶检测分析和Western blotting实验。以持家蛋白GAPDH作为内参照。结果与野生型CRX蛋白的表达导致牛视紫红质启动子表达5倍的激活率相比,CRX/c.C766T（p.Q256X）突变所造成的相应激活率降至1/4。共表达野生型CRX和NRL基因后,激活率增高至30倍,而共转染CRX/c.C766T和NRL后,牛视紫红质蛋白的活性降至1/13。以持家蛋白GAPDH作为内参,可见存在CRX/c.C766T突变时,CRX蛋白的稳态水平大幅下降,且CRX/c.C766T突变型对NRL蛋白的稳态有一定的影响,出现NRL增高的现象。结论在细胞水平上,CRX基因的c.C766T（p.Q256X）突变可降低所调控的视紫红质蛋白的表达,并对CRX蛋白和NRL蛋白的稳态均造成一定的影响。     

H1299细胞中P1k3对p73转录活性的影响

背景与目的:研究表明蛋白激酶P1k3可以增加肿瘤抑制因子p53的转录活性,但对p73转录活性的影响尚不清楚,因此本实验旨在研究蛋白激酶P1k3对p73转录活性的影响.方法:选用p53缺失型人类肺癌细胞系H1299,采用荧光素酶报告剂分析、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及克隆形成实验的方法研究蛋白激酶P1k3及激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73转录活性的影响.结果:荧光素酶报告剂分析结果显示,单独转染p73基因可以增加p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达(P<0.05);共转染p73基因和P1k3基因,p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达与单独转染p73基因组相比显著降低(P<0.05),且呈浓度依赖性;而激酶活性缺失的Plk3(K52R)对p21~(WAF1)和Bax启动子介导的荧光素酶的表达没有显著影响(P>0.05).RT-PCR检测结果也显示,p73诱导p2~(WAF1)和Bax的mRNA表达(P<0.05),P1k3降低了p73诱导的p21~(WAF1)和Bax的mRNA表达水平(P<0.05);而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73诱导的p21~(WAF1)和Bax的mRNA表达水平无显著影响(P>0.05).克隆形成实验结果显示,p73抑制了H1299细胞克隆的形成(P<0.05),P1k3降低了p73对H1299细胞克隆形成的抑制(P<0.05),而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73抑制H1299细胞克隆形成无显著影响(P>0.05).结论:P1k3可以抑制p73的转录活性,而激酶活性缺失的P1k3(K52R)对p73的转录活性无明显影响.     

siRNA干扰ERK1/2表达对食管癌细胞 ezrin 基因的转录调控作用

 目的：检测siRNA干扰细胞外信号调节激酶ERK1/2基因表达对 ezrin 基因的转录调控作用,探讨食管癌细胞 ezrin 基因的表达调控机制。 方法：采用定量RT-PCR技术,检测转染ERK1/2 siRNA对食管癌EC109细胞ERK1/2和 ezrin 基因 mRNA表达水平的影响;采用双荧光素酶报告基因分析系统,检测siRNA干扰ERK1/2表达对EC109 细胞 ezrin 基因启动子活性的影响。 结果：在食管癌EC109细胞中,转染ERK1/2 siRNA,降低ERK1/2和 ezrin 基因的mRNA表达水平以及 ezrin 基因启动子活性。 结论：ERK1/2对食管癌细胞 ezrin 基因的转录具有调控作用。     

LUNX基因增强子的克隆及调控活性分析

目的 鉴定人肺特异性X蛋白(lungspecific X protein,LUNX)基因的增强子及其调控活性.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增生物信息学预测的3个增强子片段(E1:+3770～+3959bp;E2:+6454～+6555bp;E3:+14553～+14652bp),通过荧光素酶报告基因表达体系检测转录活性.结果 PCR产物经测序证实后,分别定向连接至pGL3-Promoter载体中报告基因启动子上游的KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点和报告基因下游的BamHI和SalⅠ酶切位点上,经酶切鉴定后,构建了6种荧光素酶报告基因表达体系.以pSV-β-Galactosidase质粒为内对照,瞬时转染HEK293细胞,培养48h后检测细胞裂解液中荧光素酶活性.当3个DNA片段位于报告基因启动子上游时,均不具有增强转录的能力.将它们分别连接于报告基因下游时,E1和E3所调控的荧光索酶活性分别是对照pGL3-Promoter的2.83倍(P<0.05)和1.59倍(p<0.05).结论 LUNX基因的+3770～+3959bp和+14553～+14652bp序列具有增强转录的能力,为LUNX表达调控机制的深入研究奠定了基础.     

MiR-30a-3p靶基因的预测与验证

目的:预测和验证miR-30a-3p的靶基因。方法:利用生物信息学方法预测miR-30a-3p的靶基因;扩增靶基因3'UTR区,与pmirGLO质粒连接构建靶基因融合表达载体后与miR-30a-3p mimics共同转染到人正常滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a-3p与靶基因的靶向关系;在HTR-8/SVneo细胞中转染miR-30a-3p mimics,利用Western Blot实验检测靶蛋白表达水平。结果:生物信息学方法预测结果显示胰岛素样生长因子-1(IGF-1)为miR-30a-3p靶基因之一;双荧光素酶报告基因实验显示,IGF-1基因3'UTR区中含有明确的miR-30a-3p结合位点;Western Blot实验结果显示HTR-8/SVneo细胞转染miR-30a-3p mimics后,IGF-1蛋白表达水平明显下调(P0.05)。结论:miR-30a-3p与IGF-1有确切的靶向关系,miR-30a-3p能够负性调控IGF-1蛋白水平的表达。     

人支气管上皮细胞中苯并芘诱导TNF-α表达的分子机制

目的：构建肿瘤坏死因子-α（TNF-α）启动子双荧光素酶报告基因载体,研究苯并芘（B[a]P）暴露对TNF-α mRNA表达的调控机制。方法：采用Real time-PCR技术检测B[a]P暴露下,人支气管上皮细胞（Beas-2B）中TNF-α mRNA随时间的变化趋势。通过分子克隆技术构建TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体并检测其活性。进一步检测Beas-2B细胞和人肾上皮细胞293T细胞暴露于B[a]P环境下,TNF-α启动子活性的变化趋势。结果：Real time-PCR检测B[a]P暴露下,24 h内,Beas-2B细胞中TNF-α mRNA表达量随时间延长升高。且B[a]P刺激Beas-2B细胞24 h内,TNF-α启动子活性也呈升高趋势。B[a]P刺激293T细胞,TNF-α启动子活性也会升高。结论：成功构建了TNF-α启动子双荧光素酶报告基因载体。而且,B[a]P能够促进TNF-α mRNA的转录从而促进TNF-α mRNA的表达,且promoter1要比promoter2活性强,没有细胞特异性。     

Gluc-Fluc双荧光素酶质粒转染MB49细胞后荧光表达特性

目的利用生物发光成像技术对Gluc-Fluc双荧光素酶质粒转染MB49膀胱癌细胞后双荧光表达量变化特性进行研究。方法用pAAV2neo-Gluc和pAAV2neoCAG-Gluc-2A-Fluc分别转染MB49细胞,利用荧光照度计来研究双荧光素酶质粒中Gluc、Fluc的特性;利用体外活体成像系统对双荧光素酶质粒Gluc-Fluc转染MB49膀胱癌细胞后荧光表达情况的检测。结果荧光照度计检测结果显示:Gluc随着细胞数的增多或时间的延长,荧光表达量呈相应的增加。Fluc随细胞数目的增多,荧光表达量增加;但随时间的延长,荧光表达量变化不大。体外活体成像结果显示:Gluc-Fluc双荧光素酶质粒已转染入MB49膀胱癌细胞,经过G418加压筛选获得稳定表达的细胞株。结论双荧光素酶基因的构建并未改变Gluc的自身荧光表达特性。转染双荧光素酶质粒的MB49膀胱癌细胞,由于其Fluc在活体成像时的定位优势和Gluc易分泌、检测灵敏度高的定量优势,为后期动态检测肿瘤生长变化以及评价药物治疗效果提供了一个可靠的基石和平台。