新细胞因子趋化素样因子（CKLF1的发现与新药开发

 目的 从人类基因组发现和开发新药靶标是新世纪药物开发的热点领域,并显现出良好的前景。本综述介绍作者实验室从人类基因组发现的新细胞因子趋化素样因子 （chemokine-like factor 1,CKLF1,后续研究发现包括国内外多家实验室的研究工作。方法 总经经过近10年的研究,包括国内外多家实验室细胞水平、动物体内及临床疾病相关性研究。结果 CKLF1是一个新的非典型趋化因子,具有广谱的趋化活性,并发挥促进炎症的效应,而CKLF1的C端衍生肽CKLF1-C19是一个潜在的CKLF1拮抗肽。在小鼠哮喘模型中,CKLF1-C19可明显抑制Th2细胞和嗜酸性粒细胞在肺部的浸润,降低气道反应性。结论 CKLF1-C19有望成为新的抗炎多肽药物。     

抗HBsAg和抗RBC双特异minibody载体的构建及表达

目的：用抗HBsAg和抗RBC单链抗体构建双特异minibody抗体模型。方法：将人IgG1 CH3经点突变方式,在CH3界面由大分子氨基酸代替小分子氨基酸形成“knob”（T366W）（杵状结构）,另一个CH3分子由3个小分子氨基酸代替3个大分子氨基酸形成“hole”（T366S：L368A：Y407V）（臼状结构）,并在此基础上在适当位置上引入半胱氨酸残基形成二硫键（S354C：T366W／Y349C：T366S：L368A：Y407V）。 然后将“knob”和“hole”分别接连于抗HBsAg和抗RBC单链抗体基因3’端,并将两基因组装于同一表达载体中,在大肠杆菌中分泌表达。结果：依CH3界面不同共构建3种不同的表达载体,分别带有①野生型CH3;②杵臼结构（T366W／T366S：L368A：Y407V）突变型CH3,③杵臼结构加二硫键（S354C：T366W／Y349C：T366S：L368A：Y407V）突变型CH3。大肠杆菌分泌表达后,ELISA法检测抗HBsAg和抗RBC活性,3种表达上清均有相同的抗HBsAg和抗RBC活性;两种带有突变型CHE的minibody用血球凝集法可检测到抗HBsAg和抗RBC双特异活性。结论：CH3界面经适当改造可促进异源二聚体形成,并在大肠杆菌获得功能性表达,得到双特异minibody。     

人趋化因子受体CCR4的克隆与表达

目的：建立pcDI-CCR4稳定转染并具有CCR4功能性表达的细胞株,为深入研究CCR4配体提供基础。方法：利用RT－PCR技术进行人CCR4的cDNA克隆化。通过基因转染技术获得稳定转染细胞株,利用趋骅实验、钙流实验证实稳定转染细胞能有效表达CCR4并具有生物功能。结果：成功地将CCR4 cDNA克隆于真核表达质粒pcDI,转染HEK293细胞获得稳定表达CCR4的HEK293细胞,可被RANTES诱导产生趋化反应和钙内流反应。结论：建立的pcDI－CCR4稳定转染细胞株能有效表达CCR4并具有生物功能。     

人类功能基因组研究与开发的进展及对策建议

随着人类基因组计划的完成,人类功能基因组学研究成为新的热点,已经将生物医学的研究范围从对单一基因或蛋白质的研究扩展到系统和完整地对全部基因或蛋白质的研究.这一研究领域是生物技术产业和健康产业的核心,与人类的健康息息相关,并蕴藏着巨大的产业化潜能和经济、社会效益.目前,虽然人类基因组全部序列已知,但许多基因的功能仍然一无所知.根据2008年1月人类转录组数据库(H·Invitational Database.H.1nvDB)的统计,在目前已注释的34 057个人类编码基因中,有功能报道的只有12 404个(表1)[1].因此,大量人类新基因和蛋白的功能及开发研究仍有待于我们发掘.     

人重组胱天蛋白酶原-3的表达和体外活化

目的:建立一个在短时间内获取大量活化胱天蛋白酶-3的方法.方法:将胱天蛋白酶-3酶原的基因从真核表达载体中克隆到原核表达载体pMTY4-His中,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达MS2-胱天蛋白酶原-3融合蛋白;将包涵体变性,经酸化和浓缩进行体外活化;对所得蛋白用Western blot和活性试验进行鉴定.结果:构建成pMTY4-His-胱天蛋白酶-3原核表达载体,在大肠杆菌中获得了较高水平表达的胱天蛋白酶原-3酶原-MS2融合蛋白.体外活化后每升诱导菌可获得约10 mg蛋白,用抗胱天蛋白酶-3单克隆抗体证实所得蛋白为胱天蛋白酶原-3,活性试验证实得到高活性的蛋白.结论: 成功地建立了大量获取高活性的胱天蛋白酶-3的方法,为深入研究胱天蛋白酶-3的功能和性质提供物质基础.     

小鼠凋亡相关新基因TFAR15的克隆和序列分析

目的克隆人白血病细胞凋亡相关新基因TFAR15的小鼠同源序列 ,并比较其在不同种属间的序列同源性。方法利用EST(expressedsequencetag)拼排、RT PCR、DNA序列测定和计算机分析技术 ,对小鼠TFAR15进行研究。结果首次成功地进行了小鼠TFAR15全长cDNA的克隆和序列分析 ,发现小鼠TFAR15与小鼠其它cDNA没有明显的同源性 ,因此提交GenBank并被收录 ,登录号为AF159368。小鼠TFAR15和人TFAR15在核苷酸水平上有92.3 %的同源性 ,在氨基酸水平上有高达98.6 %的同源性 ;同时发现小鼠TFAR15在氨基酸水平上与线虫C14A4.11蛋白质有38 %的同源性。功能区分析发现 ,小鼠TFAR15cDNA序列含编码212个氨基酸的开放读码框架 ,有2个可能的N 糖基化位点 ,3个可能的caseinkinaseII磷酸化位点 ,4个可能的PKC磷酸化位点 ,并且可能是一种胞浆蛋白(cytoplasmicprotein)。结论小鼠TFAR15是进化上高度保守的新基因 ,可能具有重要的功能。     

用点突变PCR方法去除人IL—2 cDNA表达克隆终止密码及其鉴定

在重组人ＩＬ－２（ｈＩＬ－２）大肠杆菌高效表达的基础上，为了构建ｈＩＬ－２与别的目的蛋白的嵌合分子，我们利用点突变ＰＣＲ方法去除ＩＬ－２ ｃＤＮＡ表达克隆的终止密码，并构建成ｈＩＬ－２嵌合重组蛋白表达克隆，在大肠杆菌中表达的ＩＬ－２嵌合重组蛋白具有天然ＩＬ－２分子的生物活性，本文结果表明点突变ＰＣＲ去除ｃＤＮＡ终止密码的方法效率高，快速。简便。     

人GM-CSF cDNA的分离和鉴定

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor,GM-CSF、是由活化T细胞产生的一种淋巴因子,它可刺激中性粒细胞,巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的祖细胞增殖和分化,在造血系统中起重要的调节作用。为进行GM-CSF的基因工程,我们对人GM-CSF的cDNA进行     

人血清清蛋白cDNA克隆的免疫酶法筛选及其鉴定

报道了用免疫酶法从人肝细胞cDNA文库中筛选清蛋白cDNA克隆的过程。所得到的克隆用免疫学方法及内切酶水解法进行鉴定。在7个阳性克隆中,有8个cDNA克隆分子的叠加占据了整个清蛋白cDNA编码区的长度     

重组人白细胞介素3对健康恒河猴造血功能作用的研究

本文研究ｒｈＩＬ－３对健康恒河猴的造血功能作用。体外实验结果表明ｒｈＩＬ－３能有效刺激造血祖细胞的增殖和分化，其中对嗜碱和嗜酸细胞比对中性粒细胞更显著。ｒｈＩＬ－３静脉注入后，使周围血白细胞升高为注射的２．２倍，嗜碱和喊酸粒细胞分别为注射的１７．５倍和９．９倍，中性粒细胞轻度升高为注射前的２．７３倍，对红细胞和血小板无明显影响。注射７天后血清中ｒｈＩＬ－３抗体显著增高，影响其效果。