苏州地区耐左氧氟沙星无乳链球菌临床分离株分子及质谱学特征分析

摘要：目的?回顾分析苏州地区临床分离左氧氟沙星耐药无乳链球菌菌株分子及蛋白质谱学特征。方法?收集2018年1月至2019年1月临床连续分离非重复耐左氧氟沙星无乳链球菌58株，用PCR法及Sanger基因测序方法检测gyrA、parC和parE基因突变、细菌血清型以及多位点序列分型；用ClinPro Tools 3.0软件对左氧氟沙星耐药菌株蛋白质谱特征峰进行筛选并验证。结果?测序检出耐左氧氟沙星菌株以携带gyrA_Ser81Leu+parC_Ser79Tyr+parE_His225Tyr突变为主，占44.8%(26/58)，以血清Ⅲ型和ST19型为主，并伴有血清Ⅰb型及ST23型流行；耐药菌株蛋白质谱峰分析显示6 894、3 445、5 076、4 544以及3 721 m/z为主要特征峰。结论?本地区耐左氧氟沙星无乳链球菌主要为gyrA_Ser81Leu+parC_Ser79Tyr+parE_His225Tyr突变，且以血清Ⅲ型及ST19型为主，具有以6 894 m/z为代表的质谱特征峰。     

白藜芦醇通过核因子-κB信号通路抑制脑缺血基质金属蛋白酶功能上调

目的 揭示白藜芦醇抑制脑缺血基质金属蛋白酶(MMP)-9功能上调的分子机制及其与核因子(NF)-κB信号通路联系.方法 建立大鼠四动脉前脑缺血模型,采用免疫印迹技术观察缺血后再灌海马脑区MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位的变化;给予自由基清除剂白藜芦醇或NF-κB抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯(DTC),识别NF-κB信号通路是否参与了白藜芦醇对脑缺血MMP-9蛋白表达的调控.结果 脑缺血/再灌诱导海马脑区MMP-9蛋白水平和NF-κB核易位增加(P＜0.05).PDTC能一定程度的抑制缺血后MMP-9基因表达(P＜0.05).白藜芦醇能显著抑制脑缺血NF-κB核易位和MMP-9表达上调(P＜0.05).结论 脑缺血再灌,诱导MMP-9依赖NF-κB通路的蛋白水平增加,白藜芦醇能通过抑制NF-κB通路下调MMP-9的功能,继而阻断MMP-9激活介导的胞外基质降解及海马脑区损伤.     

miR-196a调控p27kip1促进非小细胞肺癌细胞增殖的机制研究

目的 探讨miR-196a在非小细胞肺癌（NSCLC）组织及细胞系中的表达,以及抑制或过表达miR-196a对NSCLC细胞增殖能力的影响及其作用的靶基因。方法 实时定量PCR（QPCR）技术检测NSCLC组织及细胞系中miR-196a的表达水平,通过转染miR-196a inhibitors及miR-196a mimics抑制或上调miR-196a的表达水平,并通过QPCR检测转染效率。用MTT和克隆形成实验检测上调或下调miR-196a对SPC-A1或A549细胞增殖能力的影响;生物信息学及Western blotting方法分析验证miR-196a对靶基因p27kip1的调控作用。结果 与正常肺组织及细胞相比,在NSCLC组织和细胞中miR-196a的表达出现显著上调,SPC-A1细胞和A549细胞中转染miR-196a inhibitors或miR-196a mimics能显著抑制或上调miR-196a的表达;抑制miR-196a的表达能降低SPC-A1细胞增殖能力,而上调miR-196a的表达则能促进A549细胞增殖。miR-196a能够负性调控p27kip1的表达。结论NSCLC组织及细胞中miR-196a的表达上调能够抑制p27kip1的表达,并显著促进NSCLC细胞增殖,影响NSCLC的发生与发展。     

二氢杨梅素对胃癌细胞 SGC7901生长活性及凋亡的影响

目的：研究藤茶中提取的二氢杨梅素(DMY)对胃癌细胞 SGC7901生长的影响,以筛选高效低毒的抗肿瘤药物。方法使用超声中性水浸提法提取藤茶中的活性成分 DMY,反相高效液相色谱(RP-HPLC)对提取物进行分离纯化,纯度达99%以上,CCK-8比色法检测纯化后的 DMY 对肿瘤细胞存活率的影响;流式细胞术检测 DMY 促进细胞凋亡的能力。结果直接从野生藤茶中提取 DMY,经过 RP-HPLC 分离纯化后的 DMY 的纯度达到99%,DMY 在低浓度时(≤1 mmol)对肿瘤细胞具有显著的杀伤效应(P <0.05),且其抑制率与药物浓度呈剂量-效应关系;同时 DMY 具有促进细胞凋亡的能力,且其促凋亡作用随着浓度的增加而增强。结论藤茶中提取的 DMY 具有显著杀伤胃癌细胞 SGC7901的效应,将来可能成为治疗肿瘤的一类药物。     

HCVF蛋白和负性共刺激分子2B4与慢性HCV感染的关联研究

目的 探讨丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）F蛋白的产生与负性共刺激分子2B4在慢性HCV感染中的关联性。方法 收集慢性HCV患者（chronic hepatitis patient,CHP）的血液样本,检测F抗体（F antibody,F-Ab）的阳性率并依据结果分成（HCV-F（+）组、HCV-F（-）组）两组,收集健康者的血液样本作为对照组;分离并培养外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,收集各孔细胞,酶联免疫吸附试验检测2B4抗体阻断前后白细胞介素4（interleukin 4,IL-4）、干扰素γ（interferon γ,IFN-γ）的表达水平。结果 2B4抗体阻断前,HCV患者PBMCs中IFN-γ和IL-4分泌水平均较健康组高（均有P<0.05）,且HCV-F（-）组分泌IFN-γ水平高于HCV-F（+）组（F=1.908,P=0.020）,而IL-4分泌水平低于HCV-F（+）组（F=1.342,P=0.009）。2B4抗体阻断后,健康组中IFN-γ和IL-4水平较阻断前均无统计学意义（均有P>0.05）,CHP IFN-γ分泌水平较阻断前升高（F=1.214,P=0.003）,且HCV-F（-）组升高程度高于HCV-F（+）组（F=1.434,P=0.009）;而IL-4分泌水平较阻断前明显降低（F=1.505,P=0.015）,且HCV-F（-）组降低程度低于HCV-F（+）组（F=1.444,P=0.032）。结论 在慢性HCV感染中,F蛋白的信号调控机制与负性共刺激分子2B4具有相关性。     

胰岛素样生长因子Ⅱ基因在大鼠INS-1细胞中表达的调控

目的 研究不同浓度葡萄糖对INS－1细胞IGF－Ⅱ基因表达的调节及对INS－1细胞增殖的作用，并比较其对IGF－Ⅱ与胰岛素基因表达的关系。方法 采用Northern杂交分析IGF－ⅡmRNA表达，用^3H-胸腺嘧啶掺入法检测细胞增生。结果 IGF－Ⅱ在INS－1细胞中表达。当葡萄糖浓度为10－20mmol/L时，IGF－ⅡmNRA表达量提高3倍以上。佛波醇十四乙酸对INS－1细胞的IGF－ⅡmNRA的表达及增生不起作用，而Forskolin可抑制INS－1细胞的IGF－Ⅱ mRNA表达。结论 高浓度葡萄糖促进INS－1细胞中IGF－Ⅱ mRNA表达，低浓度的葡萄糖环境中胰岛素mRNA的表达量高。     

RIG-I上调抑制胰腺β细胞增殖机制研究

目的:探讨维甲酸诱导基因I(retinoic acid inducible gene-I,RIG-I)在小鼠胰岛β细胞株NIT-1生长中的作用及其相关分子机制?方法:应用不同浓度(1?5?10?20?50和100 μmol/L)的RIG-I特异性激动剂维甲酸(retinoic acid,RA)分别刺激NIT-1细胞6?12?24 h,上调RIG-I?MTT法检测细胞生长活力;real-time PCR测定RIG-I的 mRNA水平;免疫印迹法检测RIG-I和细胞周期蛋白P27蛋白水平;EdU和流式细胞术检测β细胞的增殖和分裂周期?结果:维甲酸处理能刺激NIT-1细胞RIG-I蛋白水平增加(P < 0.05),能剂量依赖地抑制NIT-1细胞生长活力(P < 0.05),且诱导NIT-1细胞G1期阻滞和周期抑制蛋白P27蛋白水平增加(P < 0.05)?结论:RIG-I的功能增强能诱导小鼠胰岛β细胞P27蛋白水平上调,一定条件下抑制β细胞增殖和诱导细胞周期G1期阻滞,从而导致机体胰岛β细胞整体功能的失代偿,可能是2 型糖尿病发生发展的重要诱因?     

重组腺病毒△N IkBα的构建及其对A549细胞中NF-kB活性的抑制

目的：探讨△N IkBα基因对NF—kB活性的调节作用。方法：构建去除Ser^32和Ser^36磷酸化位点的IkBα重组腺病毒——Ad—△N IkBα。A549细胞分为3组：即LPS组、Ad—LacZ LPS组和Ad—△N IkBα LPS组．LPS组单纯用内毒素(LPS)激活NF—kB；Ad—LacZ LPS组及Ad—△N IkBα LPS组在用LPS前2d，分别感染Ad—LacZ和Ad—△N IkBα。用western blot、电泳迁移率变动分析(EMSA)和ELISA法分别检测LPS刺激后5h，细胞总蛋白中NF—kB的活性和培养上清中TNF—α及IL-6的含量。结果：Ad—△N IkBα LPS组NF—kB的活性，TNF—α和IL-6的含量，均显著低于LPS组及Ad—LacZ LPS组。结论：突变后的IkBα可明显抑制NF—kB活化，减少TNF—α和IL-6的释放，有望成为一种强有力的抗炎治疗制剂。     

慢病毒载体的构建及其介导的绿色荧光蛋白在胰岛β细胞中的表达

目的获得能够在大鼠胰岛β细胞中高效表达的慢病毒载体。方法以PCR的方法扩增绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)片段,并将其通过穿梭质粒装入pLenti6/V5表达质粒,然后用脂质体转染试剂将plenti6/V5GFP、pLP1、pLP2以及pLP/VSVG转染入293FT细胞,获得的病毒用人纤维瘤细胞系的HT1080细胞进行滴定。然后用一定滴度的慢病毒转导大鼠胰岛β细胞系INS-1,观察转导效率。结果通过限制性内切酶和琼脂糖凝胶电泳方法,观察到所克隆入pLenti6/V5表达质粒的GFP片段大小正好与PCR扩增出的片段一致。经测序验证,序列与NCBI网站上GFP序列完全一致。转染结果显示,经293FT细胞所产生的慢病毒,转导效率达到80%以上。而在1×106/ml病毒颗粒的情况下,AAV-GFP病毒几乎不能转导β细胞。结论与同一滴度的AAV-GFP病毒相比,胰岛β细胞的转导效率有非常显著的差异。即慢病毒载体表达系统在对胰岛β细胞转导的能力上,明显优于重组腺辅病毒表达系统。表明慢病毒载体在糖尿病基因治疗中,特别是对胰岛β细胞的转基因工作中,有着良好的应用前景。