嗜酸乳杆菌黏附派伊尔结及抑制病原菌侵袭性的研究

目的 研究嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)FN001I黏附小鼠派伊尔结的黏附介导物,以及L. acidophilus FN001抑制病原菌黏附及侵袭派伊尔结的效果.方法 通过化学、酶预处理研究黏附因子性质,通过单糖抑制黏附的性质研究黏附特异性.利用3种竞争黏附试验研究L aci-dophilus FN001抑制病原菌黏附的作用,利用小肠结扎段法及电镜观察L. acidophilus FN001抑制大肠杆菌侵袭派伊尔结的效果.结果 蛋白酶处理可以显著降低黏附,高碘酸处理可以显著增强黏附,甘露糖和甲基-α-D-甘露糖可以显著抑制黏附,L.acidophilus FN001可不同程度抑制病原菌黏附派伊尔结,对大肠杆菌效果最佳.结论 L. ncidophilus FN001通过蛋白样物质利用甘露糖特异方式黏附大鼠派伊尔结.L. acidophilus FN001可抑制通过相似方式黏附派伊尔结的病原菌.     

携带pEGFPC3的减毒鼠伤寒沙门氏菌在雏鸡体内的表达

构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL8786/pEGFP-C3,检测了PEGFP-C3在雏鸡体内荧光表达.将重组减毒鼠伤寒沙门菌SL8786/pEGFP-C3分别灌胃饲服3日龄雏鸡,结果表明,在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传20代后,单个菌落和菌液均呈淡绿色.流式细胞仪结果证实,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入脾脏细胞,并在其中表达.在体内稳定试验中,经雏鸡连续传代12次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的.用免疫剂量的重组细菌接种雏鸡后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变.免疫一定时间后,在雏鸡肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达.表达PEGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌在鸡体产生荧光表达,为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型.     

一种新的阿片肽对小鼠脑和小肠组织阿片受体和肽转运载体基因的影响

目的:从转录水平研究一种新的外源阿片肽 YPFPGPIRYG经胃肠道途径对小鼠脑组织和小肠组织阿片受体和肽转运载体基因的影响．方法:24只小鼠随机分为阿片肽样品组n= 12)和对照组(n=12),在饮水中分别添加浓度为8×10-7mol/L的阿片肽样品YPFPGPIRYG 和双蒸水(空白对照组),小鼠连续饮用2 wk．提取受试小鼠脑组织和小肠组织的总RNA, RT-PCR检测μ阿片受体、δ阿片受体和肽转运载体PepT1 mRNA的变化情况．结果:小鼠的脑组织中同时有μ阿片受体和δ阿片受体mRNA的表达,但阿片肽组小鼠与对照组相比,脑组织中μ阿片受体和δ阿片受体 mRNA的丰度没有变化;小鼠的小肠中同时有μ阿片受体、δ阿片受体和肽转运载体PepT1 mRNA的表达,且阿片肽组小鼠小肠中的μ阿片受体和δ阿片受体mRNA的表达与对照组相比明显上调(P<0．05),而肽转运载体PepT1 mRNA的丰度与对照组相比没有差异．结论:小鼠组织中不同阿片受体的表达存在明显的组织特异性,阿片肽YPFPGPIRYG对小鼠的生理调节不是通过与中枢神经系统上的阿片受体结合发挥作用,其可能与小肠上的δ和μ阿片受体结合发挥作用．     

多重PCR合成天蚕素基因及其在E.Coli中的克隆

天蚕素抗菌肤是食品领域中研究最多的昆虫抗菌多肤。通过对62种天蚕素低级结构的研究，设计出4条全新抗菌肤序列。应用多重PCR方法合成设计多肤的全基因序列，酶切PCR扩增产物和克隆载体puc19，构建重组质粒并将其转化到大肠杆菌中。测序结果表明目的片段已经成功克隆到宿主菌JM109中。     

重组小分子多肽的SDS-PAGE分析方法

比较了小分子多肽SDS PAGE的各种显色方法 ,结果表明 ,考马斯亮蓝R 2 5 0染色需要 3μg以上的样品 ,相对分子质量 30 0 0左右的肽才能得到清晰条带 ,而对含量低的基因工程产物不能显色 .银染可用于检测微量的分子多肽 ,银染过程中用戊二醛和甲醛进行敏化而减少固定时间 ,可显著提高检测灵敏度 ,是检测微量基因工程产物的好方法     

外源核苷酸对小鼠免疫功能的影响

目的 :　本实验研究了日粮核苷酸促进免疫抑制小鼠的免疫功能恢复的作用。方法 :　选取 5～ 6 w龄 ,体重为 (2 0± 2 ) g的健康昆明种小鼠 6 0只 ,设 0、0 .0 5 %、0 .2 5 %三个核苷酸水平处理 ,每个处理中又分成正常和免疫抑制两个组 ,其中所有免疫抑制组在实验的第 2 d一次性大剂量腹腔注射环磷酰胺 (1 5 0 mg/kg bw) ,制备免疫抑制模型 ;正常组注射等同剂量的生理盐水。饲养 1 0 d后观察小鼠增重、脾脏和胸腺的脏器指数、脾淋巴细胞转化率、脾脏中抗 SRBC抗体形成细胞数量以及血清中抗 SRBC抗体水平。结果 :　日粮中添加核苷酸能够提高正常小鼠的增重 (P<0 .0 5 )、胸腺指数、淋巴细胞转化率 (P<0 .0 5 )及血清中抗体水平 ,极显著提高免疫抑制小鼠抗体水平 (P<0 .0 1 ) ,使抑制小鼠的各项指标接近正常。抗 SRBC抗体形成细胞数量没有显著变化。结论 :　在无核苷酸日粮中添加核苷酸能够促进正常小鼠免疫功能的提高 ,使免疫抑制小鼠免疫功能得到改善。     

乳酸杆菌肽聚糖的分离鉴定及其免疫活性

研究了乳酸杆菌细胞壁肽聚糖的分离、鉴定及其对肽聚糖生物活性的影响.实验获得了SDS处理粗细胞壁的适宜条件为SDS质量浓度8g/dL,处理时间为沸水浴10min.SDS结合胰蛋白酶和TCA处理,可有效去除乳酸杆菌中的非共价结合蛋白质及共价结合蛋白质.经化学分析鉴定,所提取的乳酸杆菌成分为肽聚糖,肽聚糖中丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸浓度分别为1.181,0.943,0.770和0.456mmol/g,是肽聚糖中的组分氨基酸.SDS结合TCA处理,方能较有效地去除DNA.TCA处理是去除细胞壁磷壁酸、脂磷壁酸的有效方法.此外,小白鼠腹腔巨噬细胞的吞噬实验、C3b受体实验以及血清溶菌酶活力实验证实,所分离纯化肽聚糖的免疫学活性未受影响.     

电泳制备家蝇幼虫抗菌肽及其性质

通过体壁损伤法诱导家蝇幼虫产生免疫血淋巴,经沸水浴热变性,透析浓缩处理,后经Tricine SDS PAGE得到诱导前后家蝇幼虫血淋巴中蛋白差异表达带,将该条带电泳回收,复性,抗菌活性检测等步骤,分离纯化得到3种抗菌肽:MDL 1、MDL 2、MDL 3.研究结果表明:MDL 1分子中富含Gly,相对分子质量为6200,对革兰氏阴性菌E.coli有较强抗性;MDL 2分子中富含Pro,相对分子质量为11000,对革兰氏阴性菌E.coli和革兰氏阳性菌S.aureus均有抗性;MDL 3分子中富含Gly,相对分子质量为14000,对革兰氏阳性菌S.aureus有较强抗性;3种抗菌肽具有很强的温度耐受性,均没有凝血活性和溶血活性.同时电泳制备抗菌肽的实验方法为此类微量生物活性物质的分离纯化提供了有效的途径.     

阿片生物活性肽的基因设计、化学合成及克隆

在阿片类生物活性短肽的结构和生理特点基础之上,通过重复叠加的方法设计了此类生物活性肽基因.借助Primer软件,设计了3条引物;并通过引物延伸和PCR等步骤,实现了基因的人工合成并克隆至表达载体pPIC9K.PCR及酶切鉴定后测序,表明所合成基因已成功克隆.     

阿片肽酿酒酵母工程菌摇瓶发酵工艺

研究了发酵培养基成分、补加方式及外源氨基酸对酿酒酵母发酵和表达的影响．结果表明，发酵前在液体发酵培养基中一次性补加酵母抽提物（YE）有利于目的产物的表达，发酵过程中补加YE不利于目的产物的表达，发酵中后期补加适量的葡萄糖有利于阿片肽的表达．添加外源氨基酸对酿酒酵母工程菌的生长有一定的促进作用，而且可以明显地影响阿片肽的表达．通过正交实验对酿酒酵母生长和表达条件进行优化，确定最优工艺参数为：培养基中酵母抽提物质量浓度为25g／L，C：N比2．8，培养基初始PH5．0，摇床转速220r／min．在最优条件下研究了酿酒酵母表达目的产物的情况，总蛋白质质量浓度为614．50mg／L．SDS-PAGE电泳和双波长凝胶扫描结果表明：目的阿片肽约占总分泌蛋白质的5％，其表达量为30．7mg／L，是优化前的1．49倍。