PAI-2ΔCD突变体的构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

目的构建ＰＡＩ－２ΔＣＤ突变体基因,实现在大肠杆菌中的表达并建立重组人ＰＡＩ－２ΔＣＤ的分离纯化方法。方法用ＰＣＲ扩增ＰＡＩ－２ΔＣＤ基因,经限制性内切酶片段分析及核苷酸序列分析后,突变体基因与原核表达载体ｐＬＹ－４重组并转化蛋白酶缺陷型菌株ＪＦ１１２５。经温度诱导表达,表达产物用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法和纤溶抑制活性测定等方法鉴定。工程菌发酵后,经高压匀浆破菌,用离子交换、疏水性色谱和分子筛进行分离。结果经温度诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证实在相应相对分子质量处出现表达条带,约占全菌总蛋白的１５％。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法证实表达产物具有ＰＡＩ－２免疫原性,溶圈抑制法及翻转板法证实表达产物具有纤溶抑制活性。５Ｌ发酵菌液可得湿菌约１００ｇ,经多步纯化后,每升发酵菌液可得纯度达９７％的ＰＡＩ－２ΔＣＤ约３６ｍｇ,比活性为２８６４０ＡＩＵ／ｍｇ。结论成功构建了ＰＡＩ－２ΔＣＤ突变体,实现了在大肠杆菌中的表达,并成功地分离纯化了重组人ＰＡＩ－２ΔＣＤ蛋白。     

Overexpression and purification of enzymatically active recombinant integrase protein of rous sarcoma virus

The carboxy-terminal domain of polymerase gene of Rous sarcoma virus was cloned into an expression vector under the control oflac regulatory elements, resulting in the plasmid pMF1413. Upon isopropyl--D-thiogalactopyranoside induction, viral integration (IN) protein was expressed in large quantity inEscherichia coli. The expressed recombinant protein was prepurified by successive washing of the bacterial pellet with 0.1 M NaCl and detergents. Further purification was performed in high yield by standard chromatography methods. The purified enzyme revealed selective DNA cleaving activity on supercoiled plasmid with the LTR-LTR junction fragment. The reaction was metal ion dependent, with a preference for Mn²⁺ over Mg²⁺, and showed substrate specificity at 1 mM MnCl₂.     

一种在多糖分离纯化过程中新的脱蛋白方法

目的　寻找一种在多糖 (香菇多糖 )分离纯化过程中适宜的脱蛋白方法。方法　以正交试验法为主。结果　通过正交试验法找到了一种在多糖 (香菇多糖 )分离纯化过程中新的脱蛋白方法。 5因素 3水平正交试验的结果表明 ,影响脱蛋白率 ( DPR)的主要因素是 B(正丁醇 )、次主要因素是 D(乙醇 ) ,而因素 C(甲醇 )和 E(氯化钠 )的影响则较小 ;影响 DPR的主次顺序为 B>D>A(氯仿 ) >E>C。 DPR随着正丁醇浓度的增加而变化很大 ,开始缓慢上升 ,然后迅速降低 ;随着乙醇浓度的增大 ,DPR逐渐降低 ;而当氯仿浓度增大时 ,DPR则开始上升 ,然后下降 ;当甲醇浓度增大时 ,DPR则变化很小。脱蛋白的最佳条件是 A2 B2 C1 D1 E2 ,即在氯仿 4 0 %、正丁醇 10 %、甲醇 2 %、乙醇4 0 %、氯化钠 0 .0 1%的条件下 ,杂蛋白的去除率最高。验证性试验结果表明 ,在此条件下 ,杂蛋白的去除率达99.98 %。通过反复试验 ,还找到了适用于工业化生产的包括香菇原料的蒸煮、煮沸样品的浓缩、粗多糖的沉淀和脱色、粗多糖的干燥等在内的原料预处理的最佳工艺。结论　这种新的脱蛋白方法具有工艺简单、无需贵重设备、加工成本低、容易放大等特点 ,特别适合于多糖类产品的精制或其他需要去除杂蛋白的单元操作     

生化过程工程与中药现代化

在生化工程20余年的研究工作基础上。结合中药现代化开展了一些技术、材料与设备的研究开发工作。研究植物细胞、组织、器官大规模培养增殖技术，应用于细胞代谢产物、生物转化和人工育种及发根，实现了工厂化生产，并成功研制多种类型的生物反应器；在原有化学工程提取分离技术的基础上，发展了反应分离耦合、微波辅助提取等新技术，实现了高效浸出，并且节能、节水；此外，又发展了包括反胶团萃取、一步三相萃取青霉素、泡沫分级分离、膜分离、高速逆流色谱分离纯化等新技术。高速逆流色谱技术是一种没有固相载体的液一液多级逆流萃取技术，避免了不可逆吸附，已成功用于多种天然产物的分析和分离，作为研究中药指纹图谱的新方法具有很好的精密度和重现性。高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳、质谱等技术在指纹图谱研究中发挥了重要作用。与此同时，还研制了多种分离介质，并在药物的修饰与包埋方面做了大量工作。另外，在海洋药物研究领域，创造了连续培养连续采收的新流程、新技术．进行了转基因藻的培养。用于生产基因工程产品。     

人His6-IFNγ/TNFβ(His6γ-TNFNβ)融合蛋白(包涵体)的分离、纯化与复性研究

应用pET28(含T_7lac启动子和His6-tag)质粒,将人γTNFβ融合基因与之组建成pETγLT表达质粒,并转化于E.coliBL21(DE3).本文对pETγLT/ BL21(DE3)工程菌的His6-γTNFβ重组产物进行了诱导表达,分离纯化的研究.结果表明,该工程菌用LB培养基在37℃扩增至OD_(590)为0.5左右,加IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导5小时,此时His6-γTNFβ的表达量可占菌体总蛋白的45%.重组产物绝大多数以IBs形式存在于菌体中.工程菌经反复超声破碎、高速离心,得IBs粗制品后,再经含2mol/L脲的缓冲液洗涤可得到相对纯净的IBs.然后用7mol/L脲变性溶解IBs,离心取上清,进行Ni~(2 )-Sepharose 6B柱一步法亲和层析,可得到电泳纯度为95%的His6-γTNFβ,经稀释复性和用凝血酶切去His6-tag的产物,其细胞毒活性为(1.2～2.0)×10~7U/mgp,抗病毒活性为(6.0～6.6)×10~6U/map.     

蜜环菌菌索多糖的分离纯化及其部分理化性质

 目的：测定纯化蜜环菌菌索多糖（简称Am）组分的部分理化性质，以进一步了解Am结构和功能的关系。方法：用超滤、醇析法将蜜环菌(Armillariella mellea)菌索的水溶性多糖进行粗提，再经Saphadex G-150柱色谱纯化。结果和结论：Am为均一性组分，其[α]²⁵_D为+50°，不含蛋白质，相对分子量为13.8万，Dische反应呈阳性。水解产物为D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-木糖和半乳糖醛酸。红外光谱分析证明Am的组成单体为吡喃糖，含有乙酰氨基官能团。     

人血管内皮细胞生长因子基因克隆、表达与纯化

目的研究人血管内皮细胞生长因子121(hVEGF121)基因在pET-24a(+)中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的rhVEGF121。方法提取人原髓白血病细胞(HL60)总RNA,RT-PCR扩增hVEGF121基因,经DNA序列分析后,克隆于高效原核表达载体pET-24a(+),并转化到大肠杆菌B121(DE3)中,经IPTG诱导表达,超滤复性,DEAESephamseFastFlow阴离子交换和SephacryS-100分子筛色谱纯化后,以HUVEC测定其生物学活性。结果SDS-PAGE结果显示,目的蛋白质以包涵体形式存在,表达量达菌体总蛋白质的20%,纯化后rhVEGF121纯度达95%以上,生物学活性检测证实,具有刺激HUVEC增殖的功能。结论在原核系统中实现了hVEGF121的高效表达。     

武汉市桶装饮用水生产企业洁净灌装间的净化效果

目的了解武汉市桶装饮用水生产企业灌装间空气洁净装置的净化效果。方法于2002年按照GB50073—2001《洁净厂房设计规范》、GB／T16294—1996（（医药工业洁净室（区）悬浮粒子的测试方法》、GB／T16249一1996（医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》，对32家桶装水生产企业的灌装车间空气洁净度进行检测，依据GB17324—1998（瓶装饮用纯净水卫生标准》、GB8537—1995（（饮用天然矿泉水卫生标准》、CJ94-1999（饮用净水水质标准》进行检测。结果32家企业灌装间尘埃数的合格率为78．1％，细菌总数合格率为81．3％。按洁净度分级结果显示，符合10000级标准的灌装车间为25户，占78．1％；符合1000级的有8户，占25％；而生产线局部符合100级的有2户，占6.3％。灌装间温度、照度、噪声的合格率均为84．4％；风速的合格率最高，为87．5％；相对湿度合格率为46．9％；室内外压差合格率为34．4％，实施卫生规范化管理后，桶装饮用水的微生物指标合格率从2001年的61．1％上升为2002年的84．1％。结论桶装饮用水灌装问采用洁净装置可以提高桶装饮用水的微生物学的卫生质量。     

不同水质处理器净水效果的研究

目的观察各类水质处理器的净水效果,筛选安全可靠净水材料.方法选择各类水质处理器,按统一的条件,连续进行0,15,30,60 d的加标水样实验研究.结果活性炭的有效过滤水量时间较长,铜锌合金(KDF)次之,分子筛最短.分子筛对无机物质有一定净化功能;KDF对重金属过滤效果较好,但FDK的本身物质锌溶出量高;活性炭在有效净水量时对挥发性有机物和耗氧量吸附效果好.中空纤维对细菌和浊度过滤效果好,对重金属和小分子有机物与聚丙烯棉芯(PP)过滤率相近;PP对大颗粒物有较好净化功能.活性炭与中空纤维过滤吸附功能较好,能滤除大部分微生物、挥发性有机物、悬浮物;反渗透对各种物质均有较高滤除功能;活性炭与微孔膜过滤水量较多,净化率较低.结论不同净水材料的有效净水量不同,吸附过滤情况不同,活性炭与膜过滤器组合式水质处理器净水效果较好.     

梅岭霉素的分离纯化

利用南昌霉素在较低pH介质中加热时易降解而梅岭霉素较稳定的性质,结合溶剂萃取法除去杂质,纯化梅岭霉素.经全波长扫描、HPLC和质谱分析等,推测梅岭霉素同系物的分子结构.