基于转录组测序方法研究加替沙星对小鼠的肝损伤作用

目的： 探讨加替沙星（GAT）对小鼠肝脏的损伤作用及其机制。方法： 选取32只SPF级雄性昆明小鼠作为研究对象，随机分为4组：低、中、高剂量（分别为25、50、100 mg/kg） GAT组和对照组。给药体积按10 mL/kg，连续灌胃给药7 d，对照组给予对应体积的生理盐水。通过检测各组小鼠血清中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、肌酐（CRE）和甘油三酯（TG）浓度，初步评价加替沙星导致的小鼠肝组织损伤。进一步利用转录组测序技术检测各组小鼠肝脏的基因表达谱，筛选差异表达基因，对差异基因进行基因本体论（GO）功能分类，并采用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行信号通路富集分析。结果： 与对照组比较，高剂量GAT组小鼠肝脏质量显著降低（P<0.01）；低、中剂量GAT组肝脏系数显著降低（P<0.01）；低、中剂量GAT组小鼠血清ALT浓度显著降低（P<0.05或0.01）；低剂量GAT组小鼠血清AST浓度显著降低（P<0.01）。与对照组比较，中剂量GAT组共筛选出27个差异表达基因（包括20个上调基因，7个下调基因）。GO功能分类提示这些基因主要富集在免疫系统、多细胞生物、多生物及生殖过程等17个生物过程中。KEGG通路分析提示差异基因主要富集于脂质代谢、萜类化合物和聚酮化合物的代谢等22条通路中。结论： GAT可导致小鼠肝功能发生变化，并通过影响小鼠肝脏内胆汁酸和胆固醇等内分泌系统和脂质代谢等的平衡，造成肝组织损伤。     

生慧汤对APP/PS1雄性AD小鼠海马内APP代谢产物的昼夜变化影响＊

目的研究生慧汤对APP/PS1（β-amyloid precursor protein/presenilin 1246E）小鼠海马内β淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP）代谢产物昼夜表达的影响。方法 将56只雄性APP/PS1双转基因痴呆模型小鼠随机分为4组，分别为：痴呆模型组、褪黑素治疗组（0.78 mg·kg^-1·d^-1）、生慧汤高剂量组（27.0 g·kg^-1·d^-1）、生慧汤低剂量组（13.5 g·kg^-1·d^-1），每组14只；对照组为14只雄性C57BL/6J小鼠，连续给药30天。采用Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力，采用酶联免疫吸附检测（ELISA）检测不同时间段取出的海马组织sAPPα含量。对海马β淀粉样蛋白_1-40、β淀粉样蛋白_1-42表达进行免疫印迹分析。免疫组化（IHC）检测海马CA1区Aβ_1-40蛋白的表达。结果 Morris水迷宫结果表明，与对照组相比，模型组上平台潜伏期明显延长、穿越平台次数明显减少（P<0.01）；与模型组相比，生慧汤不同剂量组上平台潜伏期明显缩短（P<0.01、P<0.05），穿越平台次数明显增加（P<0.05）。ELISA结果表明，与对照组相比，模型组的sAPPα总量、各时间段（12：00、24：00）sAPPα含量明显减少（P<0.01）；与模型组相比，生慧汤不同剂量组sAPPα总量明显增多（P<0.01、P<0.05），生慧汤高剂量组仅能增加12：00 sAPPα含量（P<0.01），生慧汤低剂量组仅能增加24：00 sAPPα含量（P<0.05）。对照组sAPPα含量具有明显昼夜差异（P<0.01）。模型组sAPPα含量的昼夜差异性消失（P>0.05）。生慧汤高剂量组sAPPα含量具有昼夜差异（P<0.01），生慧汤低剂量组sAPPα含量不具有昼夜差异（P>0.05）。Western blot结果显示，与对照组相比，模型组Aβ_1-40、Aβ_1-42蛋白表达明显增加（P<0.01）；与模型组相比，生慧汤高剂量组Aβ_1-40、Aβ_1-42蛋白表达减少（P<0.05、P<0.01）；生慧汤低剂量组仅能减少Aβ_1-40蛋白的表达（P<0.05），对Aβ_1-42蛋白表达无影响（P>0.05）。免疫组化结果表明，与对照组相比，模型组Aβ_1-40表达明显增加（P<0.01）；与模型组相比，生慧汤不同剂量组Aβ_1-40表达不同程度减少（P<0.01、P<0.05）。结论 生慧汤能够改善5月龄APP/PS1阿尔茨海默病模型小鼠的学习记忆障碍，其机制可能与恢复海马内APP代谢产物sAPPα的昼夜节律性表达、从而减少Aβ的沉积有关。     

褐藻胶对肝豆状核变性小鼠肝脏的保护作用机制研究

[摘要] 目的：研究褐藻胶对肝豆状核变性（HLD）小鼠肝脏的保护作用机制。方法：健康雄性昆明小鼠，应用铜负荷饮食法建立HLD模型。治疗组每天给予褐藻胶灌胃，对照组动物同步给予等体积的生理盐水灌胃，每日1次，连续4周。电感耦合等离子体质谱法检测尿铜含量；生化法检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性、血清总蛋白和白蛋白含量；HE染色观察肝细胞病理变化；Masson染色观察肝纤维化程度；TUNEL检测肝细胞凋亡；免疫组化检测肝细胞铜蓝蛋白（CER）表达水平。结果：经褐藻胶治疗后，高剂量组小鼠的尿铜含量较模型组显著降低（P<0.05），血清ALT、AST活性较模型组显著降低（P<0.05）。肝细胞变性指数、肝纤维化程度和凋亡细胞指数较模型组均显著减少（P<0.05），肝细胞CER表达水平较模型组显著升高（P<0.05）。结论：褐藻胶可能通过增强肝细胞CER的表达和促进Cu2+的排泄，减轻肝细胞变性凋亡和肝纤维化损害，改善HLD小鼠的肝功能。     

细胞增殖新技术可发现新生肝细胞来源

近日,中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(生物化学与细胞生物学研究所)周斌研究组开发了一种可以长时间不间断捕捉细胞增殖的新技术--ProTracer,该技术既可以在长时间内不间断地追踪细胞增殖,又可以精准定位,追踪某一特定细胞类群(如肝细胞)的细胞增殖,让黑夜中只有被锁定目标的“星群”发光,而不是在满天繁星中找寻其中的一两颗。在小鼠实验中,他们利用这项技术,给增殖的肝细胞打上“唯一标记”,经过长达数周至数月的“密切”追踪,最终发现成体肝脏中新生肝细胞主要来源于肝小叶中间区域的肝细胞。     

基于Dusp9介导的ASK1-JNKp38信号通路探讨当归芍药散对非酒精性脂肪肝模型小鼠的作用机制

目的:从Dusp9介导的肝脏ASK1-JNKp38信号通路角度探讨当归芍药散对非酒精性脂肪肝模型小鼠的作用机制.方法:雄性小鼠60只,随机分为正常组10只及造模组50只.造模组予高反式脂肪酸高果糖饲料复合高糖饮水诱导10周,正常组同期予正常饲料喂养.造模成功后将造模组小鼠随机分为模型组、ASK1抑制剂组和当归芍药散高、中、低剂量组,每组10只.当归芍药散各剂量组分别每日灌胃给予1.29、2.58、5.16 g/kg体质量的药液,ASK1抑制剂组每日灌胃给予30 mg/kg体质量ASK1抑制剂,正常组、模型组小鼠以等量饮用水灌胃,连续6周,此期间各组继续给予相应饲料及饮水.实验第16周末,各组小鼠腹腔注射麻醉后取肝组织,采用PCR检测肝组织Dusp9基因表达情况,免疫组化染色法检测肝组织Dusp9蛋白的表达,Western blot检测肝组织Dusp9、p-ASK1、p-JNK以及p-p38蛋白水平.结果:模型组小鼠肝组织Dusp9基因表达、蛋白表达均较正常组显著降低(P<0.01),p-ASK1、p-JNK、p-p38蛋白表达均较正常组显著升高(P<0.01).当归芍药散各剂量组小鼠肝组织Dusp9基因和蛋白表达均明显高于模型组(P<0.01,P<0.05),对蛋白表达的影响呈现剂量依赖性.当归芍药散各剂量组小鼠肝组织p-ASK1、p-JNK蛋白表达显著低于模型组(P<0.01),中、高剂量组p-p38蛋白表达明显低于模型组(P<0.01);高剂量组p-ASK1表达明显低于中、低剂量组(P<0.01);随着剂量升高,p-JNK表达逐渐降低,组间差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);高、中剂量组p-p38蛋白表达明显低于低剂量组(P<0.01).结论:当归芍药散可通过Dusp9介导的肝脏ASK1-JNKp38信号通路影响非酒精性脂肪肝小鼠模型,此通路可能是当归芍药散治疗非酒精性脂肪肝的主要作用机制.     

百草枯致小鼠肺泡上皮细胞损伤过程中microRNA表达谱分析

目的 研究百草枯(PQ)致小鼠肺泡上皮细胞损伤过程中microRNA(miRNA)表达谱的变化,并预测差异表达的miRNA靶基因和相关的生物学功能.方法 体外培养小鼠肺泡上皮细胞系MLE12细胞,加入不同浓度的PQ,通过CCK-8方法检测细胞活力以及流式细胞术检测细胞凋亡率,最终选择100μ MPQ作为合适的实验浓度.进一步设立对照组和实验组,对照组加入等量PBS的培养液,实验组加入100μ MPQ的培养液,24h后用基因芯片检测两组microRNA表达谱的改变,分析差异表达的miRNA并用生物信息学方法预测靶基因及相关信号调节通路.结果 100μmol/LPQ处理MLE-12细胞24h后,细胞活性下降约50％,细胞凋亡率约15％.基因芯片共筛选出11个差异表达的miRNA,其中1个被上调,10个被下调.预测这些上下调的miRNA靶基因与细胞的线粒体凋亡途径以及DNA的甲基化相关,参与PI3K-Akt、mTOR、RAS、TNF和MAPK等与氧化应激以及凋亡相关的信号通路的调节.结论 PQ对小鼠肺泡上皮细胞的损伤进程中microRNA表达谱发生了改变,这些差异表达的miRNA可能是细胞氧化应激及凋亡的重要调节因素.     

成年小鼠颈5脊髓钳夹损伤模型的制备与评价

目的 :制备小鼠C5脊髓背侧及背外侧束钳夹损伤模型,评价损伤后动物的行为学和组织学表现。方法:采用C57/BL成年小鼠为实验对象,将16只动物随机分为损伤组和对照组,每组8只。动物麻醉后,切开背侧颈部皮肤,显露并切除小鼠C5椎板,损伤组采用自制改良FST DUMONT 5号手术钳分别钳夹背侧皮质脊髓束(dCST)和脊髓背外侧束两次;对照组仅切除椎板不做脊髓钳夹损伤。分别在术前和术后3d、2周、4周、6周、8周时采用圆筒实验、水平楼梯实验和食物抓取实验评价动物的行为学表现;术后8周时采用BDA顺行示踪观察皮质脊髓束(CST)和红核脊髓束(RST)在损伤后的情况。结果:钳夹损伤后,小鼠后肢步行功能正常但肢体的精细活动能力受到明显影响。在圆筒实验中,损伤组小鼠伤侧前肢的使用频率下降,前肢梳洗动作幅度受限,伤后各时间点与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05);在水平楼梯实验中,损伤组小鼠对横梁的抓握精确性降低,伤后各时间点与对照组相比差异有统计学意义(P0.05);在食物抓取实验中,损伤组小鼠的食物抓取能力也出现了明显受限,伤后各时间点与对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。以上行为学结果在伤后3d达高峰,2周后逐渐恢复,但直至8周仍不达正常水平。术后8周顺行示踪结果显示对照组小鼠CST和RST均显露清晰,纤维束呈纵行排列;损伤组小鼠CST和RST在损伤处大量断裂、逆向崩解,且无再生迹象。结论:成年小鼠C5脊髓钳夹损伤模型能够方便观察动物随意运动的控制情况及评价轴突的再生状况,适合作为轴突再生的研究模型。     

当归补血汤对宫颈癌荷瘤小鼠抑瘤效果及对免疫调节作用的研究

目的:探讨当归补血汤对宫颈癌荷瘤小鼠抑瘤效果及免疫调节作用。方法:以宫颈癌荷瘤小鼠为实验模型(小鼠宫颈癌U14细胞接种于Balb/c小鼠双侧大腿内侧皮下),共40只,将其分成两组,每组20只,A组喂药当归补血汤,B组给与等量的蒸馏水灌胃,持续16周,测量治疗前后肿瘤大小,计算肿瘤生长率。在免疫抑制模型基础建立宫颈癌荷瘤小鼠40只,分成两组,每组20只,C组喂药当归补血汤,D组予以等量蒸馏水灌胃,2周后断颈,取胸腺、脾脏称量,计算胸腺指数和脾脏指数。结果:灌胃16周后,A组存活10只,B组存活3只,A组与B组相比,体重较B组明显增加,生存时间明显延长,根据生存状态评分两组综合评分具有统计学差异(P<0.05)。A组用药4周、8周、12周后肿瘤体积均明显小于B组(P<0.01),A组用药4周、8周后肿瘤生长率明显低于B组(P<0.01),用药12周后肿瘤生长率比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组的胸腺指数和脾脏指数显著高于D组,差异比较有统计学意义(P<0.01)。结论:当归补血汤对宫颈癌荷瘤小鼠抑瘤效果明显,对免疫状态有调节作用。     

灌饲牙龈卟啉单胞菌对小鼠肠道炎症影响的研究

目的　研究灌饲牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）对C57bl/6小鼠结肠炎症的诱导作用。方法　将P. gingivalis ATCC33277液体增菌后备用。将15只C57bl/6小鼠适应1周后随机均分为3组，高浓度组灌饲1 × 109 CFU P. gingivalis，低浓度组灌饲1 × 108 CFU P. gingivalis，而对照组则灌饲等量无菌BHI培养液。每只小鼠每天灌饲1次，3周后处死小鼠，采集结肠及脾脏组织，行HE染色观察组织学变化，并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测结肠组织中CD3抗原（CD3 antigen，epsilon polypeptide，CD3）、受体型蛋白酪氨酸磷酸酶C（protein tyrosine phosphatase，receptor type C，B220）、黏附G蛋白偶联受体E1（adhesion G protein-coupled receptor E1，F4/80）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）及干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）的表达水平。结果　HE染色显示高浓度组小鼠结肠黏膜下结缔组织中淋巴滤泡增多，且高浓度组小鼠脾指数出现增高的趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05）。qRT-PCR结果显示，与对照组及低浓度组相比，高浓度组小鼠的结肠组织中B220及TGF-β的表达水平显著增高（P < 0.05），其余指标表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）。结论　P. gingivalis可诱导结肠炎症，从而增加牙周病患者对消化系统疾病的易感性，且其可能与牙周病病情的严重程度相关。