超声介导自制白蛋白微泡和声诺维对体外报告基因转染效率的比较研究

目的:探讨超声介导微泡破裂法促进外源基因的安全转移的方法,为临床上肿瘤等疾病的基因治疗研究提供新的思路。方法:以绿色荧光蛋白基因为标记基因,以人大肠癌细胞株SW480为靶细胞,分别以自制白蛋白微泡和声诺维(SonoVue)微泡作为载体,通过超声介导微泡破裂法促进绿色荧光蛋白GFP基因在人大肠癌细胞株的定向转染,以激光共聚焦显微镜来定性和半定量观察GFP在靶细胞的表达情况,以椎虫蓝染色法检测超声作用于细胞的安全性。结果:当超声的强度为0.75W/cm2,作用时间为40s时,对细胞比较安全;自制白蛋白微泡和声诺维微泡的浓度为10%时,分别达到最佳的基因转染效率,两者无显著性差异,但后者的相对表达强度较高。结论:超声介导微泡破裂法促进外源基因的转移是一种比较安全而有效的基因转染方法。     

青少年预防艾滋病生活技能培训的实践与体会

延边皮肤病防治院承担延边地区艾滋病防治工作。为了有效遏制艾滋病蔓延和上升，切实提高青少年生活技能，加强学校艾滋病防治宣传教育工作，增强青少年自我保护意识，了解艾滋病防治知识，抵御不良行为的诱惑，结合我州实际，从2006年起在全州选择一些重点中学对学生进行生活技能培训和同伴教育活动，使中学生对艾滋病认知程度有了较大提高，高危行为明显降低。中学生艾滋病防治知识知晓率也得以显著提高。     

抗卡波济肉瘤相关疱疹病毒vIL-6蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的制备与鉴定抗卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,v IL-6)多克隆抗体,并探讨将其初步应用于检测天然v IL-6蛋白的价值。方法设计并合成3条v IL-6候选肽,免疫新西兰兔,制备抗v IL-6多克隆抗体,用间接ELISA法鉴定该抗体的效价。构建重组质粒p HAGE-v IL-6并转染293T细胞和EA.hy926细胞,表达并纯化v IL-6-His融合蛋白,通过western blot鉴定抗v IL-6多克隆抗体对该蛋白质的识别。通过western blot和免疫荧光方法检测对KSHV阳性细胞中天然v IL-6蛋白的识别。结果由3号v IL-6候选合成肽制备的抗v IL-6多克隆抗体效价大于8 000,能特异性识别重组质粒p HAGE-v IL-6转染293T细胞和EA.hy926细胞产生的v IL-6-His融合蛋白,以及天然v IL-6蛋白。结论本实验采用合成肽作为半抗原制备的抗v IL-6多克隆抗体,可以应用于检测重组和天然v IL-6蛋白。     

CD2AP启动子的克隆和活性分析

目的 构建表达CD2AP基因转录起始位点上游启动子的表达质粒,转染人类胚胎肾(HEK)-293T细胞,评价其启动子活性.方法 以人全血细胞总DNA为模板,PCR扩增CD2AP转录起始位点上游2082 bp的启动子区片段.亚克隆此片段至无启动子活性的pGL-3基本载体荧光素酶报告基因上游的多克降位点,构建含CD2AP启动子的重组报告质粒.转染HEK-293T细胞,行荧光素酶活性检测,计算相对活性单位(RLU).生物信息学分析转录因子结合位点.结果 酶切,测序鉴定证实成功构建含有CD2AP基因转录起始位点上游2082 bp的启动区的表达质粒.CD2AP的启动子与正常的pGL-3基本质粒比较,其RLU增加了74.8倍.其上游启动子区序列中含多个转录因子结合序列如AP1、Sp1、CREB和GATA-1等.结论 CD2AP转录起始位点上游序列在HEK-293T细胞中具有较强的启动活性.     

人类疱疹病毒8型病毒干扰素调节因子编码基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆人类疱疹病毒8型(HHV-8)编码的病毒干扰素调节因子(virusinterferonregulatoryfactor,vIRF)基因K9,并将其导入真核细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的K9基因核苷酸序列设计一对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增K9基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pcDNA3.1( )中,构建重组真核表达质粒pK9。为了便于蛋白检测,再设计第二对引物,上游引物不变,在下游引物5′端引入了Flag序列。以质粒pK9为模板再次PCR,扩增K9-Flag基因,并把K9-Flag序列克隆入pcDNA3.1( )中,得到重组质粒pK9F。重组质粒经酶切鉴定,核酸序列测定和分析后瞬时转染NIH3T3细胞,用RT-PCR、Westernblot分别从核酸和蛋白水平检测K9基因的表达情况。结果:PCR分离、克隆的K9-Flag序列全长1380bp,核酸序列分析显示克隆的K9基因与GenBank中己经登记的K9基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Westernblot都在K9预期位置检测到特异性条带。结论:HHV-8K9基因在NIH3T3细胞中获得了正确表达。     

超声介导SonoVue微泡破裂促进报告基因在肝脏中表达的实验研究

目的:探讨超声介导SonoVue微泡破裂法促进外源基因在肝脏中表达的作用,评估其转染效率、安全性。方法:经SD大鼠门静脉置管输入SonoVue微泡建立动物模型,以虫荧光素酶基因为报告基因,观察不同浓度的微泡促进虫荧光素酶基因在肝脏中的表达强度与持续时间,实验结束后采下腔静脉血检测肝肾功能并取肝、肾组织常规HE染色行组织学检查。结果:随着微泡浓度的增加,虫荧光素酶基因表达逐渐增加,在微泡浓度为100%(V/V)时,转染效率最高,持续到21天仍有表达。转染前后的肝肾功能(AST、ALT、ALB、BUN、Cr)无明显变化,HE切片未发现肝肾组织结构的改变。结论:超声介导微泡破裂法能有效地促进外源基因在肝脏中的表达,为肝脏疾病的基因治疗提供了新的途径。     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的鉴定

目的:对已制备并经初筛的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体进行特异性鉴定。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA),经3次克隆选择,筛选出能稳定分泌针对K8.1蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株共9株。采用Westernblot法评价9株杂交瘤细胞培养上清识别原核表达重组K8.1蛋白和原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白的能力。结果:筛选了9株能够稳定分泌抗K8.1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Westernblot法显示,9株单抗均能特异性识别原核表达K8.1/GST融合蛋白和BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白。结论:成功制备了KSHV包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体。