SIS修复重建兔气管缺损的实验研究

目的 探讨SIS覆盖的聚丙烯补片(polypropylene mesh,PPM)修复重建兔气管缺损的可行性,及SIS在促进气管纤毛柱状上皮再生、减少术后并发症等方面的作用.方法 取12只新西兰大白兔,体重1.8～2.0 kg,制备大小为1.2 cm×0.6 cm的气管前壁、侧壁4～6环全层缺损模型.根据修复材料不同,随机分为两组,每组6只.PPM修复组采用大小为1.4 cm×0.8 cm的单纯PPM修复缺损;SIS-PPM修复组采用预先紧密缝合的大小为1.4 cm×0.8 cm的SIS和PPM修复缺损.术后观察动物一般情况,于4、8、12周取材进行大体观察、HE染色及扫描电镜观察重建区域情况.结果 术后SIS-PPM修复组动物均存活至实验完成,无感染、皮下气肿、呼吸困难发生.PPM修复组分别于术后6 d及18 d因气道感染及气道分泌物潴留死亡1只兔,其余动物均出现不同程度的颈部皮下气肿.两组动物重建气管均无塌陷、狭窄.组织学观察:术后各时间点两组动物气管腔内均未见明显肉芽及瘢痕,8、12周时重建气管表面有气管黏膜覆盖,SIS-PPM修复组纤毛组织和杯状细胞多于PPM修复组.扫描电镜观察:术后8周SIS-PPM修复组重建气管中心区域大部分被较成熟的纤毛覆盖,PPM修复组重建中心区域大部分为幼稚纤毛覆盖;12周时SIS-PPM修复组纤毛方向性好,纤毛无明显分泌物附着;PPM修复组纤毛凌乱,纤毛表面有大量分泌物附着.结论 SIS和PPM修复重建气管缺损能充分维持修复重建后的气道形态和生理功能,并能获得良好的上皮化.SIS具有促进气管黏膜修复愈合,减少术后皮下气肿、气管狭窄的作用,有望用于临床修复重建气管组织缺损.     

脊索细胞促进髓核软骨样细胞增殖及表型维持

目的分离纯化兔髓核中的细胞成分，观察脊索细胞形态及对软骨样细胞增殖及细胞表型的影响。方法6只4周龄新西兰兔胸腰段脊柱，获取髓核，0．2％Ⅱ型胶原酶消化法及不连续密度梯度法分离纯化脊索细胞及软骨样细胞。实验分为单纯软骨样细胞培养组（A组）及脊索细胞、软骨样细胞（1：1）共培养组（B组）。倒置相差显微镜观察两组细胞生长情况，测定两组原代及传代细胞成活率，MTT法测定两组第2代细胞增殖曲线，并以甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色鉴定两组原代及传代细胞蛋白多糖及Ⅱ型胶原的表达。结果成功分离、纯化脊索细胞和软骨样细胞。细胞培养观察，原代脊索细胞直径10～15gm，胞浆内富含大小不等的囊泡；原代软骨样细胞直径4～6gm，胞浆内无囊泡。各代细胞成活率A组为89．0％～95．3％，B组为91_3％～96．3％，各代细胞成活率两组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）。A组细胞培养3～4d进入对数生长期，B组细胞培养2d后进入对数生长期；培养4d后，B组细胞增殖能力高于A组，差异有统计学意义（P〈0．05）。A组3代以内细胞表达蛋白多糖及Ⅱ型胶原，B组细胞表型维持至5代。结论脊索细胞能促进髓核软骨样细胞的增殖及表型维持；脊索细胞可能在防止椎间盘退变中具有重要意义。     

异种脱钙骨基质颗粒的生物相容性实验研究

目的 评价制备的异种脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)植入体内的生物相容性,为进一步实验研究和临床应用提供依据.方法 取猪四肢长管状骨皮质骨经理化处理后,制备脱脂脱钙(材料A)和脱脂脱钙去细胞(材料B)两种粒径为250～810 μm的DBM颗粒和浸提液,骨颗粒脱脂脱钙后测钙、磷含量.采用标准的毒理学方法进行急性毒性实验、皮肤刺激实验、热原实验、溶血实验、细胞毒性实验和肌肉植入实验.结果 未脱钙皮质骨钙、磷含量分别为(189.09±3.12)mg/g和(124.73±2.87)mg/g:DBM颗粒的钙、磷含量分别为(3.48±0.09)mg/g和(3.46±0.07)mg/g;DBM颗粒钙、磷含量分别为未脱钙皮质骨的1.87%和2.69%.急性毒性实验:各组小鼠活动正常,7 d内小鼠无死亡,各组动物未见中毒症状或不良反应;7 d后各组小鼠体重日平均增加差异无统计学意义(P>0.05).皮内刺激实验观察显示,注射材料A、B浸提液和生理盐水处无明显红斑、水肿和皮肤坏死,极轻微刺激.热原实验两组动物体温升高最高均为0.4℃,符合<0.6℃的国家标准.材料A浸提液的溶血率为1.14%,材料B为0.93%,符合<5%的国家标准.异种DBM的细胞毒性为0～1级.肌肉内植入实验显示动物术后生存良好,各植入部位均未见组织坏死、积液及化脓感染.术后不同时间点植入材料A、B组局部细胞免疫定量评分比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 DBM颗粒的毒性程度为无毒,皮肤无刺激,无热原性,溶血率<5%,对细胞无明显毒性,具有良好的生物相容性和一定的骨诱导性.     

生物衍生骨-WO-1药物缓释系统结构特征和体外药物释放的研究

目的制备生物衍生骨-WO-1药物缓释系统,对其理化性质和WO-1的体外释放情况进行评价。方法采用PluronicF-127负载WO-1制作生物衍生骨-WO-1药物缓释系统。扫描电镜观察生物衍生骨及生物衍生骨-WO-1药物缓释系统形貌特征,测量其孔径和孔隙率;应用X线衍射分析仪和X线能量散射分析仪对其成分进行分析;应用高效液相色谱分析仪评价WO-1在双蒸水中1~7d的药物释放情况。结果生物衍生骨具有天然的网状孔隙结构,孔隙间互相连通;生物衍生骨-WO-1药物缓释系统也具有互相连通的网状孔隙结构,孔径和孔隙率分别为522.43±16.75μm和55%,低于生物衍生骨的孔径623.67±12.31μm和孔隙率75%。生物衍生骨-WO-1药物缓释系统主要成分为羟基磷灰石,钙/磷比为1.54;生物衍生骨钙/磷比为1.77。药物释放实验生物衍生骨-WO-1药物缓释系统1d表现为爆发释放,溶液浓度为4.6μg/ml,此后可连续释放6d,浓度维持在0.2~0.8μg/ml。结论生物衍生骨-WO-1药物缓释系统可望成为一种更佳的骨组织工程支架材料,有待于进一步进行体内研究。     

快速培养纯化猪角朊细胞及复合羊膜体外培养实验研究

目的研究快速培养和纯化猪角朊细胞的方法及观察角朊细胞在脱细胞羊膜上的生长状况,为组织工程皮肤研究提供实验依据.方法采用加10%胎牛血清的人无血清角朊细胞培养基(defined keratinocyte-SFM,DKSFM)培养原代猪角朊细胞,分别用DKSFM(A组)、加5%胎牛血清的DKSFM(B组)、加10%胎牛血清的DKSFM(C组)培养传代猪角朊细胞,于接种后1、3、5和7 d观察猪角朊细胞的形态及生长曲线.利用猪角朊细胞与培养瓶黏附牢固的特点,用0.02%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)和0.05%胰蛋白酶分步消化,纯化细胞.将第2代猪角朊细胞接种在冻干脱细胞羊膜上,直接苏木素染色、石蜡切片、免疫组织化学染色等方法观察猪角朊细胞在脱细胞羊膜上的生长状况.结果采用加10%胎牛血清的DKSFM培养原代猪角朊细胞,细胞生长速度快,形态好,培养5 d铺满培养瓶底60%～70%.B组培养的传代猪角朊细胞生长速度较C组培养猪角朊细胞生长速度快.A组培养传代的角朊细胞,细胞生长缓慢.用0.02?TA和0.05%胰蛋白酶分步消化的方法纯化猪角朊细胞,可获得纯度为95%以上的猪角朊细胞.将第2代猪角朊细胞接种在脱细胞羊膜后12 d,可形成单层细胞,呈多角形、铺路石样排列;14 d和16 d细胞进一步密集,16 d细胞出现老化.结论 10%胎牛血清的DKSFM培养原代猪角朊细胞,5%胎牛血清的DKSFM培养传代猪角朊细胞,细胞生长速度快.用0.02?TA和0.05%胰蛋白酶分步消化的方法纯化猪角朊细胞,可以获得高纯度猪角朊细胞.脱细胞羊膜为猪角朊细胞提供良好的支架,接种培养后12 d,细胞形态最好.     

犬膀胱移行上皮细胞的体外连续培养及生物学特征观察

目的探讨犬膀胱移行上皮细胞体外连续培养和纯化方法,为进一步构建组织工程尿路上皮组织提供实验依据。方法无菌获取幼犬膀胱组织,0.125%胰蛋白酶消化获取单细胞悬液,于上皮细胞无血清培养基中培养。采用0.05%胰蛋白酶和0.02?TA消化、纯化细胞,动态观察细胞形态变化和增殖情况,MTT法绘制生长曲线;透射电镜观察细胞超微结构;SABC法对培养的细胞进行免疫组织化学鉴定;并采用流式细胞仪检测不同代次细胞的细胞周期和倍体水平。结果采用酶消化法能从4～6cm2的膀胱黏膜组织中分离获取(1～5)×106个细胞。原代培养接种24h后可见大量细胞贴壁,第7天细胞生长融合达80%～90%,细胞排列呈典型的铺路石样。MTT法测定第3代细胞在传代培养7d生长达高峰;传代并纯化的细胞纯度高,无成纤维细胞污染,至第4～6代细胞仍保持良好形态。透射电镜下,可见上皮细胞特征性张力微丝和细胞间桥粒连接。细胞角蛋白AE1/AE3免疫组织化学染色,胞浆呈棕黄色阳性反应。不同代次细胞均为二倍体细胞。结论酶消化法能从较少的膀胱组织中分离获取足量、较纯的膀胱移行上皮细胞,细胞在无血清培养基中能连续传代扩增,可以满足进一步构建组织工程尿路上皮组织的需要。     

胎盘间充质干细胞与骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性研究

目的探讨兔胎盘间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSCs)和兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived MSCs,BMSCs)体外分离培养、增殖,对其生物学性状进行比较观察。方法取足月待产新西兰大耳白兔1只,采用密度梯度离心法及贴壁培养技术从兔胎盘对PMSCs进行分离、纯化和传代培养。取2周龄新西兰大耳白兔1只,采用直接贴壁法从后肢骨髓中对BMSCs进行分离、纯化和传代培养。用倒置相差显微镜观察两种细胞形态。免疫组织化学染色对第3代细胞表面标志(CD44、CD105、CD34、CD40L)进行鉴定。将BMSCs与PMSCs第2代细胞分别与生物衍生骨进行复合培养5d,每条材料接种(1.0~1.5)×106个细胞,苏木素染色观察细胞与材料复合培养情况。扫描电镜观察两种细胞分别与材料复合培养3d和8d的情况。结果在倒置相差显微镜下观察,两种细胞均为贴壁生长,形态为均一成纤维细胞样。PMSCs增殖力强,细胞的增殖能力随传代次数的增加而有所下降,细胞体外培养10代后,生长速度减慢。两种细胞均表达CD44、CD105,不表达CD34、CD40L。复合培养5d,PMSCs和BMSCs在生物衍生骨表面生长,大量黏附,细胞积聚成团,相互连接成网状,孔隙内也可见细胞生长和增殖,并分泌基质。扫描电镜观察:复合培养3d,可见较多量的细胞在生物衍生骨上黏附,呈梭形或多角形;8d两种细胞均已大量增长,呈层状排列,细胞连接紧密,分泌大量基质,细胞周围有较多的网状胶原形成。结论PMSCs与BMSCs有相似的生物学特性,可作为组织工程的另一成体干细胞来源。     

一氧化氮外源性供体L-arginine对破骨细胞骨吸收功能的影响

目的:一氧化氮在维持机体多个系统的生理功能中起重要作用,许多慢性疾病可造成一氧化氮产生减少,此时一氧化氮供体是一种必要的补充。观察一氧化氮外源性供体L-arginine对体外培养破骨细胞增殖及骨吸收功能的影响。方法:实验于2005-06/2006-05在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室完成。选择出生1d的清洁级SD大鼠乳鼠,采用骨髓诱导法体外培养破骨细胞,培养液内分别加入0.3,0.6,1.0g/L不同浓度的L-arginine,并以等体积三蒸水作为对照。培养7d后,以抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞数目、形态,MIAS-2000图像分析仪检测骨片上骨吸收陷窝的数目和面积,并用扫描电镜观察不同浓度L-arginine对骨吸收陷窝的影响。结果:①破骨细胞的一般形态:破骨细胞较其他细胞大,形态不规则,呈油煎蛋形、长条形、腊肠形或漏斗形等,细胞内可见几个至几十个核不等。抗酒石酸酸性磷酸酶染色酶活性部分酒红色,颗粒状。②抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞数:各组破骨细胞数目随着L-arginine浓度增加而减少(P<0.05)。③骨吸收陷窝的面积和数目:骨片培养7d,吸收陷窝计数的结果显示,0.3g/L以上浓度L-arginine对破骨细胞吸收功能均有明显抑制作用,并呈剂量相关性。0.3g/LL-arginine组陷窝面积为对照组的91%(P<0.05),0.6g/LL-arginine组为对照组的80%(P<0.05),1.0g/LL-arginine组为对照组的69%(P<0.01)。结论:采用骨髓诱导法培养的破骨细胞数量多、纯度高,且具有明显的骨吸收功能。L-arginine抑制破骨细胞增殖,抑制破骨细胞骨吸收功能,并呈剂量相关性。     

组织工程心肌补片对黑山羊陈旧性心肌梗死心功能和建立侧支循环的影响

目的探讨自体骨髓间充质干细胞(m arrow m esenchym a l stem ce lls,M SC s)-小肠黏膜下层(sm a llin testina l subm ucosa,S IS)构建的组织工程心肌补片,移植于陈旧性心肌梗死区后对心功能及缺血区建立侧支循环的影响。方法将已建立急性心肌梗死模型后6周的黑山羊16只,随机分为实验组和对照组,实验组抽取自体骨髓,经体外分离M SC s,进行培养、传代,以第3代细胞行5-B rdU标记并与S IS支架材料复合培养5 d,制备M SC s-S IS组织工程心肌补片。将其缝合至陈旧性心肌梗死区;对照组仅行假手术处理。于植入后6周,采用超声心动图观察两组动物心功能变化,数字减影血管造影选择性左冠状动脉造影观察缺血心肌侧支循环的建立。结果术后6周实验组及对照组:心博出量、左心室射血分数分别为42.81±4.91、37.06±4.75 m l和59.20%±5.41%和44.56%±4.23%,组间差异均有统计学意义(P<0.05);左心室舒张末期容积、左室收缩末期容积分别为72.55±8.13、83.31±8.61 m l和29.75±5.98、46.25±6.68 m l,组间差异均有统计学意义(P<0.05);左心室舒张功能各项指标分别为:E峰最大速度分别为54.85±6.35 cm/s和43.14±4.81cm/s(P<0.01);A峰最大速度分别为52.33±6.65 cm/s和56.91±6.34 cm/s(P>0.05)。超声心动图显示对照组左室腔扩张明显,室壁运动明显减弱,梗死区呈瘤样扩张,局部室壁反常运动;实验组左室腔明显小于对照组,室壁运动较对照组强,心尖梗死区扩张不明显。选择性左冠状动脉造影见实验组左冠状动脉前降支远端与回旋支间明显侧支循环建立。结论M SC s-S IS构建的组织工程心肌补片移植于黑山羊陈旧性心肌梗死区后侧支循环建立,心功能有明显改善作用。