基于TLR4/NF-κB/NLRP3通路探讨补阳还五汤调控巨噬细胞极化的作用机制

目的：基于Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(NLRP3)通路探讨补阳还五汤调控巨噬细胞极化的作用机制。方法：本实验通过采用不同浓度(0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 mg·L^-1)脂多糖(LPS)对RAW264.7巨噬细胞干预24 h,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测RAW264.7巨噬细胞存活率,筛选最适浓度建立体外LPS诱导RAW246.7巨噬细胞炎症模型。将实验分为空白组(20%空白血清),模型组(20%空白血清+10 mg·L^-1LPS),模型对照组(20%FBS+10mg·L^-1LPS),低、中、高(5%、10%、20%)补阳还五汤含药血清组及NLRP3抑制剂MCC950(50μmol·L^-1)、活性氧(ROS)抑制剂NAC(10μmol·L^-1)、NF-κB抑制剂PDTC(10μmol·L^-1)联合补阳还五汤高剂量(20%)组。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测...     

参苓白术散通过调节肠上皮细胞自噬治疗葡聚糖硫酸钠所致小鼠炎症性肠病

目的:探究参苓白术散对5%葡聚糖硫酸钠(DSS)所致BALB/c小鼠炎症性肠病(IBD)的改善作用与肠上皮细胞自噬的关系。方法:84只BALB/c小鼠,除正常组之外,5%DSS自由饮用7 d诱导急性炎症性肠病,治疗组分别给予参苓白术散高、中、低剂量组(12,6,3 g·kg-1·d-1),美沙拉嗪组(2 g·kg-1·d-1),自噬诱导剂雷帕霉素组(4 mg·kg-1·d-1)灌胃。观察小鼠体质量、粪便性状、隐血便血,计算疾病活动度(DAI)积分;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测小鼠血清中炎症因子白细胞介素-8(IL-8),IL-10含量;苏木素-伊红(HE)染色观察结肠组织病理学改变;免疫组化检测肠组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β的表达;共聚焦显微镜观察肠上皮细胞自噬体形成情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关通路蛋白的水平。结果:与模型组比较,参苓白术散组小鼠隐血,便血,体质量下降,DAI积分,病理改变等均改善;与正常组比较,模型组小鼠血清中IL-10含量显著降低,IL-8含量显著升高(P 0. 01),小鼠肠组织中IL-1β和TNF-α的表达明显升高(P 0. 01),肠上皮细胞自噬体减少,微管轻链蛋白3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值含量显著降低(P 0. 01);与模型组比较,参苓白术散可以升高小鼠血清IL-10含量,降低IL-8含量明显(P 0. 05,P 0. 01),明显降低IL-1β和TNF-α的表达(P 0. 05),参芩白术散高剂量组、雷帕霉素及美沙拉嗪组肠上皮细胞自噬体形成显著增多,显著升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ含量。结论:参苓白术散抗DSS诱导的IBD的作用与抑制炎症及调节肠上皮细胞自噬有关。     

参苓白术散抗脂多糖致肠隐窝上皮细胞损伤的作用及其机制

目的研究参苓白术散抗脂多糖(LPS)诱导肠隐窝上皮细胞(IEC-6)损伤作用及其机制。方法用200μg·mL~(-1)LPS复制模型,将IEC-6细胞分为10组:空白对照组,模型组,低(4%)、中(8%)、高(16%)剂量参苓白术散含药血清组,10%胎牛血清(FBS)阴性对照组,ROCK阻断剂Y27632组,MLCK阻断剂ML-7组,MAPK抑制剂SB203580组,ERK抑制剂PD98059组。通过MTT法检测LPS细胞毒性;用蛋白质印迹法(western blot)检测p38MAPK、ERK1/2通路蛋白水平;用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术测定肿瘤坏死因子(TNF-α)mRNA的表达;通过激光共聚焦测定细胞骨架结构蛋白纤维肌动蛋白(F-actin)的变化。结果 MTT实验中,不同浓度的LPS对IEC-6有不同程度的抑制、损伤作用。Western blot和RT-PCR结果显示,与空白对照组比较,模型组IEC-6细胞p38MAPK、磷酸化ERK1/2、TNF-αmRNA水平明显上升;而参苓白术散含药血清对其有明显的下调作用(P0.01,P0.05)。激光共聚焦检测F-actin实验中,模型组与空白组比较细胞微丝纤维表达显著增多;而参苓白术散含药血清组相对于模型组,细胞微丝纤维表达明显下降。结论参苓白术散含药血清对LPS诱导的IEC-6细胞损伤具有保护作用。     

补阳还五汤抑制同型胱氨酸介导的血管平滑肌细胞增殖

目的:探讨补阳还五汤抑制同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)介导的血管平滑肌细胞增殖及其作用机制。方法:雄性SD大鼠补阳还五汤给药剂量为14.9 g.kg-1.d-1,给药7 d制备含药血清,取适量含药血清配制含药血清为5%,10%,20%3种培养基,取对数期细胞,按照分组将5%,10%,20%含药血清培养基预处理细胞1 h后加入Hcy 2 mmol.L-1作用24 h,流式细胞技术测定细胞周期,Western-blotting(WB)测定增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的蛋白表达量,用荧光探针DCFH-DA试剂盒对细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的聚积量进行测定。结果:补阳还五汤能抑制血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)细胞周期的进程,其中5%含药血清组细胞处在S+G2期为47.34%(P<0.05),10%含药血清组为38.81%(P<0.01),20%含药血清组为27.95%(P<0.01),下调细胞内PCNA的表达(P<0.01),测得补阳还五汤给药组细胞内ROS的荧光强度较Hcy组弱。结论:补阳还五汤能显著抑制Hcy介导的VSMC增殖,其作用机制可能是通过降低细胞内ROS的聚积量。     

姜黄素对同型半胱氨酸硫内酯所致Eahy926细胞损伤的保护作用

目的 研究姜黄素对同型半胱氨酸硫内酯(HTL)诱导融合内皮细胞株(eahy926)损伤的保护作用及其机制.方法 以体外培养的eahy926细胞为研究对象,建立HTL损伤模型,检测LDH漏出量,SOD和MDA含量,通过RT-PCR法检测细胞中对氧磷酶1( PONl) mRNA,TNF-α mRNA水平.结果 姜黄素可明显降低培养液中LDH活力,显著提高培养液中SOD含量,降低MDA含量;抑制HTL刺激的培养液中TNF-α浓度的升高,提高细胞中PONl mRNA水平,降低TNF-αmRNA表达.结论姜黄素对HTL诱导的eahy926细胞损伤具有一定保护作用.     

肿瘤坏死因子-α诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的:应用肿瘤坏死因子d(TNF-α)诱导3T3-L1脂肪细胞,探讨建立可靠胰岛素抵抗(IR)细胞模型的方法.方法:3T3-L1前脂肪细胞经3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素诱导分化成3T3-L1脂肪细胞,将其与20,10,5μg·L-1TNF-α共孵育,100 nmol·L-1胰岛素作用30 min刺激脂肪细胞糖转运.以葡萄糖氧化酶法测定培养基上清液葡萄糖含量,观察TNF-α对脂肪细胞糖摄取的影响,鉴定IR模型.结果:TNF-α抑制胰岛素诱导前、后的脂肪细胞糖转运,抑制作用呈剂量依赖性,其中20 μg·L-1TNF-α的抑制率分别为79.2％和81.4％(P＜0.05).结论:肿瘤坏死因子α可诱导3T3-L1脂肪细胞产生IR,这种细胞模型简便、可靠.     

葛根对2型糖尿病大鼠胰腺内质网应激相关蛋白GRP78，ATF6表达的影响

目的:观察葛根对2型糖尿病(T2DM)大鼠的疗效及其相关作用机制。方法:90只SD大鼠分为正常组、模型组、二甲双胍组、葛根高、中、低剂量组,每组15只。对非正常组大鼠高脂高糖饲料喂养4周后采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)40 mg·kg-1制造T2DM模型。葛根高、中、低剂量组分别灌胃葛根浸膏2.1,1.4,0.7 g·kg-1,二甲双胍组灌胃盐酸二甲双胍0.2 g·kg-1,正常组和模型组灌胃等体积蒸馏水,1次/d。灌胃8周后,测量大鼠空腹血糖(FBG),糖化血清蛋白(GSP),胰岛素(FINS),甘油三脂(TG),胆固醇(TC)含量,并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);免疫组化观察胰腺组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胰腺组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78),活化转录因子6(ATF6)蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组的FBG,GSP,TG,TC,FINS,TNF-α含量明显增高(P0.05),HOMA-IR指数明显上升(P0.05),胰腺组织中GRP78,ATF6蛋白表达明显增高(P0.05);与模型组比较,二甲双胍组、葛根高、中、低剂量组FBG,GSP,TG,TC,FINS,TNF-α含量均明显降低(P0.05),HOMA-IR指数明显降低(P0.05),胰腺组织中GRP78,ATF6蛋白表达明显降低(P0.05)。结论:葛根可以显著改善T2DM大鼠胰岛素抵抗,抑制胰腺组织中炎症因子TNF-α的表达,减少胰腺组织中内质网应激相关蛋白GRP78,ATF6的表达。     

参苓白术散通过MAPK信号通路对炎症性肠炎小鼠的作用

目的探讨参苓白术散通过ERK/P38MAPK信号通路对DSS诱导的IBD(炎症性肠炎)的作用。方法 5%葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulphate,DSS)自由饮水7 d诱导BLALB/c小鼠急性炎症性肠病,同时各组小鼠予以生理盐水、柳氮磺胺吡啶、参苓白术散高、中、低剂量(12,6,3 g/kg)灌胃,采用RT-PCR及Western Blot检测各组动物肠道组织中ERK、P38MAPK的表达情况。结果小鼠结肠组织中ERK及p38MAPK水平模型组高于正常对照组,3种不同剂量的参林白术散对其表达有相应的下调。结论参苓白术散通过ERK/P38MAPK信号通路作用而起到抗DSS诱导的IBD的作用。     

补阳还五汤抗Hcy致动脉硬化作用与调控核因子-κB活性相关性的研究

 目的 探讨补阳还五汤对同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）致动脉粥样硬化（AS）的保护作用与核因子（NF）-κB的关系。方法 给予ApoE^-/-小鼠Hcy(0.1 g·kg^-1)灌胃8周后造成动脉粥样硬化（AS）模型,治疗组给予补阳还五汤（5, 10, 20 g·kg^-1）进行灌胃。8周后 HE染色观察和测量主动脉根部AS斑块面积、血管壁面积,检测主动脉NF-κB活性、活性氧（ROS）含量、I-κBα蛋白表达变化。结果 模型组AS病变明显,与正常对照组相比,主动脉组织中ROS含量显著升高（P<0.01）,I-κBα蛋白表达明显降低,NF-κB活性显著激活;不同剂量的补阳还五汤改善AS病变的同时显著降低血管组织中ROS含量、促进I-κBα蛋白表达升高,抑制NF-κB的活化。结论 补阳还五汤可能通过抑制NF-κB的活化达到抗Hcy所致动脉硬化的作用。