乙肝肝硬化、胆汁性及酒精性肝硬化肝肾阴虚证与湿热蕴结证患者血清胆汁酸代谢谱变化研究＊

目的 探析肝硬化患者肝肾阴虚证与湿热蕴结证“病证相关”的血清胆汁酸代谢变化的特征，为中医药治疗肝硬化改善胆汁淤积、胆汁酸代谢障碍方面提供参考依据。方法 临床招募315例肝硬化患者，包括肝肾阴虚证组195例和湿热蕴结证组120例，以150例健康人作为对照组，采用超高效液相色谱联用串联质谱技术(UPLC-MS/MS)对所有血清样本进行血清胆汁酸代谢谱的检测，比较3种病因肝硬化肝肾阴虚证与湿热蕴结证之间“病证相关”的血清胆汁酸代谢谱的差异。结果 肝硬化肝肾阴虚证组（195例）的初级胆汁酸β-MCA显著高于湿热蕴结证(120例) (P < 0.05)，以PBC肝肾阴虚证（55例）尤为显著，其初级胆汁酸GCA、β-MCA以及次级胆汁酸GUDCA、TUDCA、6-ketoLCA、β-UDCA、UDCA水平均显著高于HBC肝肾阴虚证组（134例）(P < 0.05)，CTP-C级时肝硬化肝肾阴虚证组（44例）初级胆汁酸CDCA、GCA、CA水平显著高于湿热蕴结证组（35例）(P < 0.05)；肝硬化湿热蕴结证组的次级胆汁酸NorDCA水平显著高于肝肾阴虚证组(P < 0.05)，ALC湿热蕴结证组（31例）的次级胆汁酸NorCA、LCA显著高于HBC湿热蕴结证组（86例）(P < 0.05)，而HBC湿热蕴结证组（86例）的次级胆汁酸NorDCA显著高于肝肾阴虚证组（134例）（P < 0.05）。结论 肝硬化肝肾阴虚证患者的胆汁淤积及肝细胞胆汁酸代谢障碍为重，PBC患者尤为显著；而肠道菌群紊乱所致次级胆汁酸水平升高可能是肝硬化湿热蕴结证的重要病理基础。     

一贯煎干预肝硬化作用机制研究进展

肝硬化是以一种或多种病因反复作用形成的以肝实质弥漫性纤维化、假小叶和再生结节形成,肝内外血管异常以致门静脉高压为特征的病理阶段,进展至失代偿期以肝功能严重损害为特征,出现腹水、胃食管静脉曲张破裂出血、肝性脑病等多种并发症,治疗上多为对症治疗,死亡率高,预后差。对于失代偿期肝硬化,中医药治疗不仅可以有效改善肝功能,且能显著提高患者的5年生存率,提示中医药在防治终末期肝病、促进肝硬化组织重构方面具有潜在优势。现代中医名家认为,肝硬化主要由气阴亏虚(肝、脾、肾)而湿热疫毒内侵,脉络瘀阻所致。肝肾阴虚是失代偿期肝硬化常见的主要证候。中医滋肾养肝方剂一贯煎是现代临床治疗慢性肝病肝肾阴虚证的代表方。由清代名医魏玉璞(魏之琇)所创,载于《续名医类案》。临床研究显示一贯煎可有效改善肝硬化患者的肝功能,促进腹水消退,减少肝性脑病等相关并发症的出现。实验研究提示一贯煎具有多途径、多层次、多靶点综合调节的特征,防治肝硬化的作用机制可能主要与抗氧化应激,改善肝脏炎症、提高肝细胞生物合成以及抑制肝星状细胞活化、减轻胶原沉积、改善肝窦血管化、促进肝细胞再生等有关。文章就近5年来关于一贯煎治疗肝硬化的临床及实验研究作一系统综述,为进一步拓展其临床应用价值提供参考。     

祛湿化瘀方对非酒精性脂肪性肝炎大鼠组织蛋白酶B和肿瘤坏死因子α表达的影响

目的：研究祛湿化瘀方防治大鼠非酒精性脂肪肝的作用机制。方法：除正常对照组5只外，Wistar雄性大鼠30只运用四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）皮下注射联合高脂低蛋白饮食建立非酒精性脂肪肝模型。自造模2周后，随机分为模型组、祛湿化瘀方组和甘乐（复方二氯醋酸二异丙胺）组，每组10只，分别予祛湿化瘀方和甘乐10ml／kg灌胃。用药2周后取材，检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）活性和肿瘤坏死因子Q（tumor necrosis factor—α，TNF—α）含量、肝组织甘油三酯（triglyceride，TG）和游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）含量；并分析其指标间的相关性。蛋白印迹法检测肝组织组织蛋白酶B（cathepsin B，Ctsb）、磷酸化kB抑制蛋白（phospho-inhibitor kappa B，P—IkB）和TNF—α蛋白表达。免疫组织化学染色检测肝组织中Ctsb表达。结果：祛湿化瘀方可显著降低模型大鼠肝组织TG（P〈0．05）、FFA（P〈0．01）含量和血清ALT活性（P〈0．05），而对照药物甘乐只显示有降低ALT活性（P〈0．05）作用；模型组肝组织Ctsb、p-IKB、TNF-α蛋白表达均高于正常对照组，同时血清TNF-α水平显著上升；而祛湿化瘀方组的上述蛋白表达则低于模型组。肝组织TG与FFA含量、血清ALT活性呈正相关；血清TNF-α与肝组织FFA含量、血清ALT活性呈正相关。结论：祛湿化瘀方抑制肝脏脂肪沉积和炎症作用可能与其抑制FFA以减轻其下游“FFA—Ctsb—TNF—α”肝脂毒性通路有关。     

Intervention effects of Jianpi Liqi Huoxue Decoction (健脾理气活血汤) on lipid peroxidative liver injury induced by alcohol

Objective： To study the intervention effects of Jianpi Liqi Huoxue Decoction （健脾理气活血汤, JLHD） on lipid peroxidative liver injury induced by alcohol. Methods： The rat alcoholic model of liver disease （ALD） induced by Lieber-DeCarli liquid diet was established. Thirty-two male SD rats were randomly divided into 4 groups ： the normal group （ n = 5）, the control group （ n = 9）, the model group （ n = 9） and the JLHD group （ n =9）. From the 4th week after modeling, the rats were given JLHD or distilled water by gastrogavage respectively, and the samples of blood and liver tissues were taken out from the rats for determination by the end of the 8th week. The hepatic pathological changes were observed with HE staining; the liver injury related indices, including activity of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） in serum, γ-glutamyl transpeptidase （γ-GT） activity and triglyceride （TG） content in liver tissues, as well as the lipid peroxidation related indices, including malonaldehyde （MDA） content and nitric oxide synthase （NOS） activity in liver tissue, serum Fe^2＋ level, and the anti-peroxidation capacity related indices, including superoxide dismutase （SOD） activity, glutathion （GSH） content and reactive oxygen species （anti- ROS） activity in liver tissues were determined. Results： （ 1 ） There were obvious figures of fatty degeneration and inflammatory infiltration in liver tissues of the model group. As compared with the control group, in the model group, the activity of ALT and AST, and Fe^2＋ content in serum, γ-GT and NOS activity, TG and MDA content in liver tissues were significantly higher （ P〈0. 01 ）, while the activity of SOD, GSH and anti-ROS in liver tissues were significantly lower （P〈0.01）. （2） The fatty degeneration and inflammatory infiltration of liver tissues in the JLHD group were significantly lessen as compared with those in the model group; and the abnormalities of all the indexes revealed in the model rats were restored to certain extent in the JLHD group, and especially significant were the levels of ALT activity, MDA content and Fe^2＋ , which were nearly normal. Conclusion： JLHD has significant effects against alcoholic liver injury, the acting mechanism of which is likely to be related with its anti-lipid peroxidative effect.     

黄芪汤对慢性胆汁淤积继发肌少症大鼠骨骼肌细胞线粒体损伤的影响

目的：基于骨骼肌细胞线粒体损伤探讨α-萘基异硫氰酸酯（ANIT）诱导慢性胆汁淤积继发肌少症大鼠的致病机制及黄芪汤的调控效应。方法：40只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、低剂量黄芪汤组、高剂量黄芪汤组,每组10只。除正常组外,其余各组给予ANIT-橄榄油溶液灌胃,隔日1次,连续40周,诱导慢性胆汁淤积继发肌少症大鼠模型。于第33周首日分别给予低、高剂量（0.59、1.76 g/kg）黄芪汤灌胃,每日1次,连续8周。第40周末次给药后,收集外周血和肝、骨骼肌组织,记录肌肉质量、肌力,HE、天狼星红染色观察肝、骨骼肌组织病理学变化,透射电镜观察骨骼肌细胞线粒体超微形态结构,生化方法检测血清肝功能指标,JC-1法检测骨骼肌细胞线粒体膜电位,生物发光法检测骨骼肌组织三磷酸腺苷（ATP）含量,Western Blot检测骨骼肌MAFbx/Atrogin-1、MuRF1、LC3B、PINK1、Bnip3、UCP2蛋白表达。结果：模型组大鼠肌肉质量、肌力,肝、骨骼肌组织病理、骨骼肌细胞线粒体超微形态结构,血清肝功能指标,骨骼肌细胞线粒体膜电位、线粒体ATP含量,骨骼肌组织MAFbx/Atr...     

野百合碱诱导大鼠肝窦阻塞综合征模型的病理机制

目的 观察不同剂量野百合碱（MCT）诱导大鼠肝窦阻塞综合征（HSOS）的病理变化，探讨造模剂量-时间致肝损伤的病理特征，并解析其部分作用机制。方法 将72只雄性SD大鼠随机分为正常组（n=12），MCT低、中、高剂量组（每组n=20）。MCT低、中、高剂量组分别采用MCT 80、120、160 mg·kg^-1灌胃一次制备模型，各剂量组大鼠于造模48、120 h处死取材。观测各组大鼠的存活率，检测大鼠体质量、肝质量与血清肝功能变化，采用扫描电镜、苏木素-伊红（HE）染色及天狼星红（SR）染色观察肝组织病理变化，微板法检测肝组织匀浆谷胱甘肽S转移酶（GST）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）和免疫组化检测肝组织相关指标的表达。结果 与正常组比较，MCT各组血清丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶（ALT/AST）活性随造模剂量增加而升高（P<0.05，P<0.01）；随造模时间增加，MCT低剂量组血清ALT和AST活性均下降（P<0.01），MCT中、高剂量组ALT和AST活性均显著升高（P<0.01）。HE染色显示MCT低、中、高剂量组肝组织肝细胞坏死、炎性细胞浸润及红细胞淤积，电镜下可见肝窦内皮窗孔扩大，“筛状”结构消失，其损伤程度随剂量提高而加重。与正常组比较，MCT低、中、高剂量组肝窦内皮细胞标志物CD44表达减少（P<0.05，P<0.01）。SR染色显示造模48 h MCT各组未见阳性染色，120 h MCT各组可见汇管区及肝窦胶原沉积。与正常组比较，MCT各剂量组肝组织MDA含量及GST活性增加，T-SOD活性降低，以MCT中、高剂量组变化显著（P<0.01）；且造模120 h MCT各组变化呈现剂量依赖性（P<0.01）。免疫组化及Western blot结果显示，与正常组比较，促炎巨噬细胞标志物CD68蛋白表达随剂量升高而增加（P<0.01），抗炎巨噬细胞CD163蛋白及mRNA表达随剂量升高而减少（P<0.01）。与正常组比较，造模后MCT中、高剂量组磷酸化核转录因子-κB/核转录因子-κB（p-NF-κB/NF-κB）、磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B（p-Akt/Akt）明显升高（P<0.05，P<0.01）。MCT造模后肝组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白表达随时间延长、剂量升高增加，α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白基因α1（Col 1a1）和Ⅳ型胶原蛋白基因α1（Col 4a1）mRNA表达也随时间延长、剂量升高而明显增加（P<0.05，P<0.01）。TUNEL染色结果显示造模后凋亡细胞数量随造模剂量升高而增加，B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白与Bcl-2相关X蛋白（Bax）比值显著降低（P<0.01）。结论 不同剂量MCT灌胃诱导的大鼠肝窦阻塞综合征，病变随剂量增加而加重。80 mg·kg^-1 MCT导致的肝脏损伤可自愈，超过120 mg·kg^-1的MCT导致的肝脏损伤会随着时间的延长而加重，甚至出现纤维化、死亡。MCT导致大鼠HSOS的病理机制可能是MCT引发肝组织内强烈的氧化应激，激活促炎巨噬细胞大量分泌炎症因子，进而激活NF-κB/Akt信号通路，导致严重的细胞损伤和死亡。     

慢性乙型肝炎患者肝肾阴虚证和湿热蕴结证血清胆汁酸谱变化

目的探索血清胆汁酸谱变化在慢性乙型肝炎肝肾阴虚证及湿热蕴结证中的辨识意义。方法临床招募355例慢性乙型肝炎患者,包括肝肾阴虚证74例、湿热内蕴证281例,以355名配对健康人作为对照组。采用超高效液相色谱三重四级杆质谱技术(UPLC-TQ-MS),定量检测血清胆汁酸谱,比较慢性乙型肝炎肝肾阴虚证、湿热蕴结证患者与健康人之间,慢乙肝患者两种证型之间血清胆汁酸谱变化差异。结果与配对的健康人比较,慢性乙型肝炎湿热蕴结证和肝肾阴虚证患者的血清总胆汁酸、甘氨酸结合型胆汁酸、牛磺酸结合型胆汁酸及未结合型胆汁酸含量,血清初级胆汁酸鹅脱氧胆酸(CDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、胆酸(CA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺胆酸(TCA)含量,血清次级胆汁酸甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、脱氧胆酸(DCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、石胆酸(LCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、λ鼠胆酸(λ-MCA)、λ甘氨鼠胆酸(Gλ-MCA)、λ牛磺鼠胆酸(Tλ-MCA)、猪脱氧胆酸(HDCA)、甘氨猪脱氧胆酸(GHDCA)、3-酮胆酸(3-KCA)、7-酮脱氧胆酸(7-KDCA)、7-酮石胆酸(7-KLCA)含量显著升高(P0.05)。慢乙肝肝肾阴虚证患者的血清初级胆汁酸CDCA、GCDCA、TCDCA、CA、GCA、TCA及血清次级胆汁酸熊脱氧胆酸(UDCA)、GUDCA、TUDCA、λ-MCA、Tλ-MCA、HDCA、GHDCA、3-KCA、原胆酸(ACA)含量显著高于湿热蕴结证患者(P0.05)。慢乙肝湿热蕴结证患者的血清次级胆汁酸GLCA、牛磺石胆酸(TLCA)含量显著高于肝肾阴虚证患者(P0.05)。结论血清胆汁酸谱有助于判识慢性乙型肝炎肝肾阴虚证及湿热蕴结证。慢乙肝肝肾阴虚证的胆汁酸代谢障碍较湿热蕴结证更为显著。     

一贯煎对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织胶原代谢的影响

目的:探讨一贯煎对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的肝纤维化大鼠肝脏胶原代谢的影响.方法:腹腔注射CCl4 9周制备大鼠肝纤维化模型,于造模第3周、第6周末各处死6只大鼠作动态观察,自第7周起将模型大鼠随机分为模型对照组和干预组.干预组于继续造模的同时给予一贯煎灌胃3周,正常组与模型对照组大鼠给予同体积蒸馏水灌胃.第9周末处死全部大鼠,采集肝组织标本,检测肝组织组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhmitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、-2,基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)、-14,α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),I型胶原(collagen type I,Col I)等的蛋白表达以及MMP-2、-9的活性.结果:与正常大鼠比较,造模第3、6和9周时肝纤维化大鼠肝组织胶原纤维增生程度增加,肝组织α-SMA、ColI、TIMP-1、TIMP-2、MMP-13、MMP-14蛋白表达和MMP-2、MMP-9活性逐渐升高(P<0.05或P<0.01);与9周模型组比较,一贯煎组大鼠胶原纤维增生程度显著减轻(P<0.05),肝组织α-SMA、Col I、TIMP-1、TIMP-2、MMP-13和MMP-14蛋白表达及MMP-2、MMP-9活性显著降低(P<0.01).结论:一贯煎可以抑制肝星状细胞活化,抑制胶原的合成,促进过度增生的胶原纤维的降解,从而抑制CCl4诱导大鼠肝硬化的形成.     

姜黄素对内毒素脂多糖诱导的库普弗细胞分泌炎症细胞因子的抑制作用

[目的]观察姜黄素对内毒素脂多糖（LPS）诱导的库普弗细胞（KC）分泌炎症细胞因子的影响。[方法]分离并培养KC48h后，分设不同浓度姜黄素组，作用于KC3h，确立无毒性的剂量范围；分正常组、LPS组、LPS加姜黄素组（分3种浓度），在添加姜黄素1h后，加LPS（0．1μg／ml培养液）刺激2h。取上清用ELISA法测定肿瘤坏死因子α（TNF-α）、放免法测白细胞介素1β（IL-1β）和IL-6水平；并以细胞免疫荧光化学法观察细胞TNF-α蛋白的表达和分布。[结果]不同浓度组姜黄素均能显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平以及细胞TNF-α蛋白的表达，量效关系显著。[结论]姜黄素对LPS诱导的KC炎症细胞因子分泌有显著的抑制作用。     

三七脂肝丸对非酒精性脂肪性肝病大鼠脂肪酸代谢的影响

目的 探讨三七脂肝丸对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠脂肪酸代谢的影响。方法 大鼠随机分为正常组、模型组、奥贝胆酸组(0.514 mg/kg)和三七脂肝丸低、中、高剂量组(0.77、1.54、3.08 g/kg),每组8只。除正常组外,其余各组采用高脂饲料喂养12周诱导建立NAFLD大鼠模型。第9周,正常组和模型组灌胃给予去离子水,其余各组分别灌胃给予相应剂量药物,连续4周,给药结束后(第12周末)收集血清和肝、回肠组织样本。生化法检测大鼠血清肝功能、脂质水平及肝组织TG、FFA水平,HE、油红O染色观察肝组织病理学变化,蛋白免疫印迹法检测肝组织FAS、ACC1、SREBP-1c、CD36、SCD-1及回肠组织ZO-1、Occludin蛋白表达。结果 与正常组比较,模型组肝指数、血清ALT、AST、TG、TC、LDL-c、FFA水平、肝组织FFA、TG水平升高(P<0.05,P<0.01),血清HDL-c水平降低(P<0.01),肝组织病理可见脂肪变性,伴有炎性细胞浸润,NAS积分和油红O阳染面积比例升高(P<0.01),肝组织FAS、ACC1、SREBP-...