z66抗体诱导伤寒沙门菌鞭毛抗原表达转变后染色体结构分析

目的 分析z66抗体诱导z66抗原阳性伤寒沙门菌鞭毛抗原表达改变后染色体结构。方法 利用脉冲凝胶电泳（PFGE）结合XbaI消化，对伤寒沙门菌标准菌株Ty2，z66抗原阳性株GIFU10007及z66抗体诱变j抗原阳性株GIFU10007-j的染色体DNA进行比较分析。结果 GIFU10007-j染色体DNA有两个XbaI片段与GIFU10007不同，总体染色体减少约250kb；与Ty2相比，GIFU10007染色体DNA有13个相同及7个不同的XbaI片段，总体染色体大小接近。结论 z66抗体诱导伤寒沙门菌鞭毛抗原表达转变后的染色体DNA发生了局部结构缺损；伤寒沙门菌z66鞭毛抗原阳性及诱变阴性株与单相标准菌株Ty2间在染色体DNA结构上有明显差异。     

FORS-D分析软件"Random_fold_scan"和不同碱基随机打乱算法对FORS-D分析的影响

目的:开发FORS-D分析软件,并比较不同碱基随机打乱算法对FORS-D分析的影响.方法:根据单、双、三碱基及密码子随机打乱算法,用ActivePerl-5.8.8.820编写"Random_fold_scan"软件,它通过系统命令调用RNA-structure4.2来计算FORS-D值.用4种碱基随机打乱算法分别计算来自不同物种的12个mRNA序列,并且比较它们对FORS-D值的影响.结果:4种随机打乱策略不影响核酸序列的FORS-D分布趋势,但是单碱基打乱算法可以获得比其他3种算法更低的FORS-D值.比较4种打乱算法获得的FORS-D值的Z-score分布,发现单碱基打乱产生的FORS-D值显著小于0的比例最高,相反,FORS-D值显著大于0的比例最低.结论:单碱基随机打乱算法能够彻底破坏原始核酸的序列信息,在概念和理论上能够真正反映FORS-D的生物学涵义.这表明FORS-D分析中单碱基打乱足以给出准确、可靠的数据信息.此外,我们开发了软件"Random_fold_scan"用于FORS-D分析.     

非编码小RNA T64对伤寒沙门菌基因表达的影响

目的: 对由转录组测序获得的伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)非编码小RNA(small non-coding RNA,snRNA)T64的表达进行验证,并对其功能进行初步探讨。方法: 选取特异性引物采用反转录PCR(RT-PCR)和普通PCR确认T64在S.Typhi中的表达;将含有T64 snRNA序列的重组质粒导入S.Typhi野生株构建T64高表达株;结合应用S.Typhi全基因组芯片分析技术,比较S.Typhi T64高表达株和空载体对照株在对数期基因表达谱差异,并对部分基因芯片结果进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。结果：RT-PCR结果显示,snRNA T64在S. Typhi确有表达;基因芯片分析结果显示,与空载体对照株比,snRNA T64高表达株在对数期有20个基因表达上调,7个下调;4个被选基因表达的qRT-PCR结果与芯片分析结果相符。结论： snRNA T64在S. Typhi中表达,可能在基因的表达调节中发挥重要作用。     

伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY的克隆表达与多克隆抗体的制备

目的: 克隆表达伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY并制备多克隆抗体。 方法: 通过PCR技术从伤寒沙门菌基因组DNA中获得伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY,再将此基因片段克隆到表达载体pET22b(+)上,并转入大肠埃希菌JM109进行表达;Ni柱纯化后的OsmY蛋白作为抗原免疫家兔,并获得多克隆抗体。 结果: 成功制备伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY的蛋白表达菌株,并获得了纯化的OsmY蛋白,成功制备兔抗OsmY的多克隆抗体。 结论： 成功克隆表达了伤寒沙门菌高渗诱导基因osmY,并获得了多克隆抗体,有助于今后研究OsmY在伤寒沙门菌高渗应激中的作用。     

伤寒沙门菌核糖核酸酶 G对胞内非编码RNA T3956水平的影响

目的: 研究伤寒沙门菌核糖核酸酶G（RNase G）对非编码RNA（ncRNA）T3956胞内水平的影响。方法: 利用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌RNase G基因（rng）缺陷变异株;利用重组质粒pBAD将rng导入rng缺陷变异株,构建rng缺陷回补株;通过实时定量PCR分别比较伤寒沙门菌野生株、rng缺陷变异株、回补株等在不同生长时期的ncRNA T3956水平。结果: 成功制备伤寒沙门菌rng缺陷变异株、rng缺陷回补株和空质粒对照株; 实时定量PCR结果表明,rng缺陷株中T3956的胞内水平较野生株有所升高,并且在对数中期和稳态期升高得更加明显,而回补株胞内T3956的水平又得到恢复。结论: 伤寒沙门菌RNase G能够参与对胞内ncRNA T3956水平的调控,并且在细菌对数生长中期和稳态期作用更为明显。     

伤寒沙门菌fljA样基因缺陷变异株的制备

目的：为探讨z66鞭毛抗原阳性伤寒沙门菌的fljA样基因的功能,制备沙门菌fljA样基因缺陷变异株。方法：根据伤寒沙门菌fljA样基因序列,设计PCR特异性引物并在5末端加接酶BglII位点,扩增fljA样基因上、下游片段,用BglII消化后,定向连接成fljA样基因的缺损性同源性核苷酸片段,先克隆至pGEM—T质粒,再经BnmHI酶切后导入自杀质粒pGMB151,电转化入伤寒沙门菌(GIFU 10007),进行同源重组。用PCR观察重组现象,将完全重组的菌株作为fljA样基因的缺陷变异株,并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。结果：PCR及序列分析证实,缺陷变异株的fljA样基因缺失231个碱基。结论：成功构建伤寒沙门菌flja样基因缺陷变异株,为进一步研究其在伤寒沙门菌鞭毛抗原表达的调控作用奠定了基础。     

伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB：z66的克隆表达及其多克隆抗体的制备

目的: 克隆表达H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66,并纯化制备相应的多克隆抗体.方法: 利用PCR 技术从H:z66阳性伤寒沙门菌基因组DNA中得到鞭毛素基因fljB:z66,将该基因克隆到表达载体pET-28a(+)上并在大肠埃希菌JM109中进行表达;fljB:z66的表达产物经Ni柱纯化后作为抗原免疫兔以制备多克隆抗体.结果: 经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66 被成功导入表达载体pET-28a(+),并在大肠埃希菌JM109中获得了高效表达,以此作为抗原成功制备了兔抗z66的多克隆抗体.结论: 成功克隆表达了H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66,并制备了相应的多克隆抗体,为今后深入研究H:z66阳性伤寒沙门菌的单向相变换机制奠定了基础.     

伤寒沙门菌fljB::lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

伤寒沙门菌fljA样基因表达载体的构建

目的：进一步明确二相伤寒沙门菌鞭毛抗原表达调节机制，系统分析伤寒沙门菌fljA样基因功能，构建含倒样基因的表达载体并验证其表达。方法：根据倒样基因两端序列设计引物，以z66抗原阳性伤寒沙门菌GIFU10007基因组为模板，通过PCR获得该基因，与表达载体pET22b连接后，重组体转化至大肠杆菌JM109中诱导培养，并通过RT-PCR观察傅4样基因表达情况。结果：基因克隆和序列分析结果显示伤寒沙门菌庳4样基因被成功导入载体pET22b，RT-PCR结果提示大肠杆菌JM109可利用此重组载体进行西4样基因表达。结论：成功获得能在大肠埃希菌中表达伤寒沙门菌西4样基因的载体。     

PmrA对伤寒沙门菌高渗应激后期基因表达调节初探

目的:探讨伤寒沙门菌调节因子PmrA在高渗应激后期对基因表达调节的影响.方法:应用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术,比较伤寒沙门菌野生株和pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期的基因表达谱差异,并选择部分差异表达基因进行RT-RCR验证.结果:经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌pmrA基因缺陷变异株在高渗应激后期有81个基因表达上调,有22 个基因表达下调.结论:PmrA在伤寒沙门菌高渗应激后期的基因表达调节中发挥重要作用.