伤寒沙门菌小RNA T64的功能

［摘要］目的: 探究小RNA T64对伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S. Typhi)表型的影响。方法: 用λ Red重组系统构建小RNA T64的基因缺失变异株,并将携带T64基因序列的重组质粒导入T64缺陷株制备T64回补株,同时将该质粒导入hfq基因缺陷变异株。绘制T64高表达株的生长曲线,观察T64对细菌生长的影响;接种半固体平板观察细菌的动力;结晶紫染色法观察细菌生物膜形成情况。 结果： 序列分析表明,T64基因缺失变异株构建成功;生长曲线显示,T64高表达促进细菌的生长;与空载体对照株相比,T64高表达株的动力稍减弱;生物膜分析结果显示,T64高表达株生物膜形成能力强于空载体对照株;回补T64基因后,T64缺陷株生物膜形成能力基本恢复,而hfq缺陷株依旧难以形成生物膜。结论： T64能促进细菌生长,且在一定程度上抑制细菌的动力;其有助于S. Typhi形成生物膜,但不足以消除hfq基因缺失对生物膜形成的抑制作用。     

伤寒沙门菌fljB::lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制,建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物,用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段,并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接,将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51,再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌,在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆,经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株,为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。     

伤寒沙门菌fljA样基因表达载体的构建

目的：进一步明确二相伤寒沙门菌鞭毛抗原表达调节机制，系统分析伤寒沙门菌fljA样基因功能，构建含倒样基因的表达载体并验证其表达。方法：根据倒样基因两端序列设计引物，以z66抗原阳性伤寒沙门菌GIFU10007基因组为模板，通过PCR获得该基因，与表达载体pET22b连接后，重组体转化至大肠杆菌JM109中诱导培养，并通过RT-PCR观察傅4样基因表达情况。结果：基因克隆和序列分析结果显示伤寒沙门菌庳4样基因被成功导入载体pET22b，RT-PCR结果提示大肠杆菌JM109可利用此重组载体进行西4样基因表达。结论：成功获得能在大肠埃希菌中表达伤寒沙门菌西4样基因的载体。     

临床生物化学及其检验课程的教学改革与实践

临床生物化学及其检验是医学检验专业的核心课程，是在人体正常的生物化学代谢基础上，研究疾病状态下，生物化学病理性变化的基础理论和相关代谢物的质与量的改变，从而为疾病的临床实验诊断、治疗监测、药物疗效和预后判断、疾病预防等方面提供信息和决策依据的一门学科。随着科学技术的快速发展，该学科涉及的领域不断扩大，检验项目日益增多，检     

重组葡萄糖脱氢酶基因的表达研究

目的：将重组的葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达,优化表达条件,以期获得较高活力的葡萄糖脱氢酶。方法：将枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因与表达载体pET22b连接后转化至大肠杆菌JM109（DE3）进行表达,经对发酵时间、诱导物浓度、诱导时间以及细胞破碎等条件的控制,实现葡萄糖脱氢酶的高表达。结果：重组质粒转化菌发酵2h后进入对数生长期,诱导剂IPTG浓度为0．5mmol／L,诱导2．5～3h后用240W超声破碎细胞,表达的粗提酶活力比诱导前提高了近干倍。SDS-PAGE电泳显示重组菌能表达单体分子量为31．5KD的特异性蛋白。结论：表达质粒的拷贝数、宿主菌培养条件、细胞破碎方式等均能影响酶的表达量。     

荧光实时定量RT-PCR观察伤寒杆菌鞭毛z66和d/j抗原基因表达方法的建立

目的：构建荧光实时定量RT-PCR测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／j编码基因mRNA的方法。方法：根据伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／i编码基因序列,设计引物扩增其读码框架内片段,克隆进pGEM-TEasy质粒。质粒经PCR鉴定后,纯化并定量,作为荧光实时定量PCR的标准品,并制作标准曲线。利用不同渗透压下的鞭毛素基因表达差异,比较三种随机引物(6、8、10核苷酸)与特异性引物的逆转录效果,以确定一种最佳的随机引物用于多基因表达观察。结果：标准曲线有较好的线性(r=0．999),cDNA和标准品的PCR产物溶解曲线峰值一致。用8核苷酸随机引物进行逆转录的敏感度高于6、10核苷酸随机引物,低于特异性引物,但用其观测z66抗原基因和d／j抗原基因在高、低渗时表达变化趋势与用特异性引物测得结果一致。结论：成功构建用8核苷酸随机引物进行逆转录同时测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d／j基因表达的荧光实时定量RT-PCR方法。     

临床生物化学及其检验教学改革初探

临床生物化学及其检验是医学检验专业的核心课程．笔者针对国家教育部关于五年制医学检验专业的培养目标，重新修订了教学大纲和课程的基本要求，对该课程体系进行了改革。该课程体系的改革，试图按国际检验医学专业人才培养目标定位，使培养的人才既符合国情需要又能与国际接轨。     

OxyR蛋白对不同应激条件下伤寒沙门菌生存能力的影响

目的：研究OxyR蛋白对伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S.Typhi)在应激条件下生存能力的影响。方法：用λ-Red系统制备S.Typhi oxyR基因缺陷变异株;通过重组质粒pBAD/gⅢ将oxyR基因和pBAD/gⅢ空质粒分别导入oxyR基因缺陷变异株;构建oxyR缺陷回补株和oxyR缺陷回补空质粒株;制作生长曲线,观察野生株、oxyR缺陷株、oxyR缺陷回补株及oxyR缺陷回补空质粒株在不同应激条件下的生长状况;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析OxyR对S.Typhi氧化调节相关基因表达的影响。结果：成功制备S.Typhi oxyR基因缺陷变异株、oxyR基因缺陷回补株和空质粒对照株;生长能力分析结果表明,与野生株相比,oxyR缺陷株在氧应激时生长缓慢(P<0.05),oxyR缺陷回补株的生长能力得到恢复;qRT-PCR结果显示,在氧应激时OxyR蛋白可以抑制hemH基因的表达,活化uxuA基因的表达。结论：OxyR蛋白参与S.Typhi对氧应激的调节,为进一步研究S.Typhi 的致病性奠定了基础。     

地塞米松对大鼠内毒素肝损伤保护作用的探讨

Ｗｉｓｔａｒ大白鼠腹腔注射Ｅ．ｃｏｌｉ内毒素纯制剂（２ｍｇ／Ｋｇ体重），１２小时后，其肝脏线粒体琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）活力显著降低（Ｐ＜０．０１），胞浆还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）水平明显下降（Ｐ＜０．０５）。线粒体内丙二醛类脂质过氧化物（ＬＰＯ）含量和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力显著增加（Ｐ均小于０．０１）。线粒体膜脂质成分ＰＥ、ＰＳ、ＰＣ含量均明显下降，ｌｙＳｏ－ＰＣ显著增加。组织学和电镜观察表现为一定程度的肝细胞损伤。用地塞米松按４ｍｇ／Ｋｇ体重，分别在内毒素处理的同时、２小时后４小时后注射。结果显示：同时注射和２小时后注射组，上述各项生化指标与内毒素组比较均有显著改善，而４小时后注射组无明显改善。     

伤寒沙门菌fljB∷lacZ变异株的制备

目的：为研究伤寒沙门菌z66鞭毛抗原编码基因fliB的表达调节机制，建立该fljB基因的β-半乳糖苷酶基因（1acZ）插入变异株。方法：采用自杀质粒介导的同源重组方法进行制备。设计加接茚nI和SalI的特异性引物，用PCR扩增获得舻基因的上、下游同源性DNA片段，并与用Kpn I和Sal I酶切pSV-β-半乳糖苷酶载体（pSV-β-galactosidase vector）的片段定向连接，将连接片段克隆至自杀质粒pGMBl51，再通过电击法将重组质粒转入伤寒沙门菌，在含X-Gal的蔗糖平板上筛选获得同源重组的变异株。结果：经筛选获得阳性克隆，经PCR及序列分析证实,fljB基因中的763bp被3550bp的lacZ片段替代。结论：成功构建伤寒沙门菌flj∷lacZ突变株，为进一步研究fljB基因表达调节机制奠定了基础。