基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立

目的建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas13a)的乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)检测方法。方法提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后,使用HindⅢ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶(PSAD)分别进行酶切;根据松弛环状DNA(rcDNA)和cccDNA的结构差异,设计特异性扩增HBV cccDNA的引物,对酶切后的产物进行滚环扩增(RCA)和PCR扩增;并筛选crRNA,建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果利用α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和HBV表面抗原(HBsAg)引物对双重酶切后的产物进行扩增,验证产物中HBV基因组的存在;利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增,验证了产物中只存在HBV cccDNA;利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释,然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测,计算出检测下限为10拷贝/μl。结论本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法,可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测,为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。     

基于转录组测序方法研究加替沙星对小鼠的肝损伤作用

目的： 探讨加替沙星（GAT）对小鼠肝脏的损伤作用及其机制。方法： 选取32只SPF级雄性昆明小鼠作为研究对象，随机分为4组：低、中、高剂量（分别为25、50、100 mg/kg） GAT组和对照组。给药体积按10 mL/kg，连续灌胃给药7 d，对照组给予对应体积的生理盐水。通过检测各组小鼠血清中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、肌酐（CRE）和甘油三酯（TG）浓度，初步评价加替沙星导致的小鼠肝组织损伤。进一步利用转录组测序技术检测各组小鼠肝脏的基因表达谱，筛选差异表达基因，对差异基因进行基因本体论（GO）功能分类，并采用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行信号通路富集分析。结果： 与对照组比较，高剂量GAT组小鼠肝脏质量显著降低（P<0.01）；低、中剂量GAT组肝脏系数显著降低（P<0.01）；低、中剂量GAT组小鼠血清ALT浓度显著降低（P<0.05或0.01）；低剂量GAT组小鼠血清AST浓度显著降低（P<0.01）。与对照组比较，中剂量GAT组共筛选出27个差异表达基因（包括20个上调基因，7个下调基因）。GO功能分类提示这些基因主要富集在免疫系统、多细胞生物、多生物及生殖过程等17个生物过程中。KEGG通路分析提示差异基因主要富集于脂质代谢、萜类化合物和聚酮化合物的代谢等22条通路中。结论： GAT可导致小鼠肝功能发生变化，并通过影响小鼠肝脏内胆汁酸和胆固醇等内分泌系统和脂质代谢等的平衡，造成肝组织损伤。     

膀胱尿路上皮癌组织中ERG蛋白表达水平与微血管密度和肿瘤分期相关性研究

目的:分析膀胱尿路上皮癌(BTCC)组织中ERG蛋白表达水平与微血管密度(MVD)和肿瘤分期的相关性。方法:选取62例BTCC患者的癌组织及癌旁组织石蜡标本,检测其ERG蛋白表达、程序性死亡受体配体-1(PD-L1)表达水平以及MVD水平。分析各蛋白阳性表达水平与肿瘤分期的关系,以及ERG、PD-L1蛋白与MVD的相关性。结果:BTCC癌组织中ERG阳性表达39例(62.90%),明显高于癌旁组织中的ERG阳性表达12例(23.08%)(P<0.05);BTCC癌组织中PD-L1阳性表达26例(41.94%),明显高于癌旁组织中的PD-L1阳性表达5例(8.06%)(P<0.05);BTCC癌组织的MVD水平明显高于BTCC癌旁组织(P<0.05)。ERG、PD-L1蛋白阳性表达率、MVD水平在病理类型、肿瘤分期、肿瘤数目中存在统计学差异,在浸润性癌、肿瘤高分期、多发性肿瘤中阳性表达率增高(均P<0.05)。ERG、PD-L1蛋白表达与MVD水平均呈正相关(r=0.426、0.357,P<0.05)。ERG蛋白表达与PD-L1呈正相关(r=0.512,P&...     

EXO1蛋白在DNA损伤中研究进展

核酸外切酶(EXO)1兼有5'端-3'端外切酶及5'端结构特异性内切酶活性[1],属于皮瓣结构特异性内切酶(Rad)2/着色性干皮病(XP)G组蛋白家族的成员。EXO1蛋白具有EXO1a及EXO1b两种异构体,其中EXO1b的C端额外具有48个氨基酸,因而活性明显优于EXO1a[1],但两者的功能并无区别。     

褐藻胶对肝豆状核变性小鼠肝脏的保护作用机制研究

[摘要] 目的：研究褐藻胶对肝豆状核变性（HLD）小鼠肝脏的保护作用机制。方法：健康雄性昆明小鼠，应用铜负荷饮食法建立HLD模型。治疗组每天给予褐藻胶灌胃，对照组动物同步给予等体积的生理盐水灌胃，每日1次，连续4周。电感耦合等离子体质谱法检测尿铜含量；生化法检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和门冬氨酸氨基转移酶（AST）活性、血清总蛋白和白蛋白含量；HE染色观察肝细胞病理变化；Masson染色观察肝纤维化程度；TUNEL检测肝细胞凋亡；免疫组化检测肝细胞铜蓝蛋白（CER）表达水平。结果：经褐藻胶治疗后，高剂量组小鼠的尿铜含量较模型组显著降低（P<0.05），血清ALT、AST活性较模型组显著降低（P<0.05）。肝细胞变性指数、肝纤维化程度和凋亡细胞指数较模型组均显著减少（P<0.05），肝细胞CER表达水平较模型组显著升高（P<0.05）。结论：褐藻胶可能通过增强肝细胞CER的表达和促进Cu2+的排泄，减轻肝细胞变性凋亡和肝纤维化损害，改善HLD小鼠的肝功能。     

骨肉瘤差异表达基因的生物信息学分析及关键基因筛选

目的筛选成骨型骨肉瘤与正常成骨细胞的差异表达基因, 寻找成骨型骨肉瘤发生、发展的关键基因。方法从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库获得正常成骨细胞和骨肉瘤组织的基因表达数据集GSE33382, 采用R语言的limma包筛选正常成骨细胞和成骨型骨肉瘤的差异表达基因, 对差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。采用String数据库构建蛋白交互网络, 应用Cytoscape软件的分子复合物检测(MCODE)插件筛选互作网络中的网络模块, 应用Cytoscape软件中的BiNGO模块对MCODE筛选得到的前3个主要模块所包含的差异表达基因进行基因本体(GO)富集分析。采用MCC算法筛选蛋白互作网络中前10个关键基因。从GEO数据库获得骨肉瘤的基因表达和生存数据集GSE39055, 采用Kaplan-Meier法进行生存分析。选取2005年1月至2015年12月福建医科大学附属第一医院收治的48例成骨型骨肉瘤患者的资料进行验证, 采用免疫组化法测定骨肉瘤组织中STC2蛋白的表达, 结合患者的临床资料进行生存分析。结果从GSE33382数据集...     

深度挖掘肝细胞癌中遗传变异对可选择性多聚腺苷酸化的影响

摘要:目的 通过整合组学和临床信息,深度挖掘肝细胞癌中重要的可选择性多聚腺苷酸化(alternativepolyadenylation,APA)数量性状基因位点(alternativepolyadenylationquantitativetraitlocus,apaQTL),并研究这些重要位点相关 的下游靶基因及上游 RNA 结合蛋白(RNA-bindingprotein,RBP)。方法 从 SNP2APA 数据库下载泛癌顺式和反式 apaQTL数据,用 R语言分析肝细胞癌apaQTL的分布特征。根据位置提取apaQTL上下游50bp范围内的序列,使用 STREME进行特征基序富集,进一步结合肝细胞癌临床信息,筛选改变基序和临床预后相关的apaQTL。利用 Tomtom 挖掘潜在调控 APA 的上游 RBP,并通过 ENCODE以及 TCGA 预后数据分别验证 RBP在 APA 调控和肝细胞癌发生发 展中的重要性。将apaQTL和表达数量性状位点(expressionquantitativetraitlocus,eQTL)进行共定位,并结合差异表 达和预后分析,筛选影响表达和预后的apaQTL和下游靶基因。结果 通过对肝细胞癌apaQTL进行特征分析,发现肝 细胞癌顺式apaQTL在其他癌症中广泛出现,而反式apaQTL在肝细胞癌中具有特异性。通过对apaQTL进行基序分 析,筛选出20个可以改变多聚腺苷酸化基序的apaQTL。其中rs16742可以生成新的多聚腺苷酸化基序,从而导致赖氨 酰-tRNA 合成酶(leucyl-tRNAsynthetase,LARS)基因的转录本增长。进一步分析表明,rs16742与肝细胞癌的预后相 关。通过预测新的apaQTL基序和上游靶基因,并结合外部数据验证,发现 RBP聚(RC)结合蛋白2[poly(RC)binding protein2,PCBP2]参与肝细胞癌 APA 事件的调控,并与预后相关。进一步分析表明,预后显著的apaQTLrs115865883 和rs150628203可能影响 PCBP2与转录本的结合。通过apaQTL和eQTL共定位分析,筛选出30个潜在的影响表达和 肝细胞癌发生发展的apaQTL和下游靶基因。结论 研究发现了一系列功能性肝细胞癌apaQTL及下游靶基因,基于 apaQTL相关分析,发现 RBPPCBP2可调控肝细胞癌的 APA 事件及预后。     

乙肝相关性肝癌临床病理学特征与高敏C反应蛋白和溶血磷脂酸表达的相关性

目的探讨乙肝相关性肝癌临床病理学特征与溶血磷脂酸(LPA)和高敏C反应蛋白(hs-CRP)表达的相关性。方法选取2019年1月至2020年1月间河南省驻马店市中心医院收治的198例乙肝相关性肝癌患者作为乙肝组,198例酒精相关性肝癌患者作为酒精组。两组患者都进行血清hs-CRP和LPA表达检测,调查患者的病理学特征并进行相关性分析。结果乙肝组患者血清hs-CRP和LPA含量均高于酒精组,差异均有统计学意义(均P <0.05)。两组患者血清ALP、AFP、ALT、AST和GGT含量比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)。乙肝组不同临床分期和组织学分化患者的血清hs-CRP和LPA含量比较,差异均有统计学意义(均P <0.05)。乙肝组患者的临床分期和组织学分化与血清hs-CRP和LPA表达均存在相关性,差异均有统计学意义(均P <0.05)。患者的临床分期和组织学分化均为影响hs-CRP和LPA表达的重要因素,差异均有统计学意义(均P <0.05)。结论相对于酒精相关性肝癌,乙肝相关性肝癌的血清hs-CRP和LPA呈现高表达,与患者的临床病理学特征存在相关性。