脱水淫羊藿素维持人尿源性干细胞干性的作用研究

目的:探究脱水淫羊藿素(DICT)对人尿源性干细胞(hUSCs)干性的影响。方法:常温离心法体外分离培养hUSCs,倒置相差显微镜下进行hUSCs形态学观察;根据MTT实验绘制hUSCs接种后1~7 d的生长曲线;流式细胞术检测hUSCs表面标志物;分别设hUSCs培养基对照组,浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μmol/L的DICT处理组,利用四甲基噻唑蓝(MTT)实验检测作用1~7 d后各组的细胞活力;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测2.0μmol/L DICT作用hUSCs 3 d后,对干性基因OCT-4、C-MYC mRNA表达的影响。结果:通过常温离心法成功获得形态良好、生长活性较高的hUSCs,hUSCs表达间充质干细胞表面标志物CD44和CD90,不表达造血干细胞表面标志物CD34和内皮细胞表面标志物CD31。2.0μmol/L DICT作用3~6 d能显著促进hUSCs的增殖,增强其生长活力(P<0.01),上调hUSCs干性基因OCT-4、C-MYC的mRNA表达(P<0.01)。结论:DICT在体外可增强hUSCs的干性。     

Metridia荧光素酶检测条件的优化

目的：探讨培养基pH、血清对Metridia荧光素酶（MLuc）检测的影响并尝试找到一种优化的检测条件。方法：构建表达MLuc的逆转录病毒载体,瞬时转染人宫颈癌细胞系HeLa,制备收获MLuc;利用化学发光仪检测不同条件下的培养基对MLuc发光性能的影响,并尝试通过不同缓冲液与试剂的组合代替培养基来获得最佳条件。结果：培养基pH变化导致MLuc发光值产生较大波动,血清的存在会导致检测背景;添加0.02%（V/V）NP-40的磷酸盐缓冲液（PBS）（pH=7.4）作为MLuc检测的缓冲体系代替培养基,其发光值大小相当,检测背景值由原来的600左右降低到20左右。结论：以添加0.02% NP-40的PBS作为MLuc检测的缓冲体系可消除培养基pH、血清的影响,使检测结果更加准确和灵敏。     

何首乌、虎杖、大黄水提物中游离蒽醌含量的测定及对人正常肝细胞的毒性作用

目的:测定何首乌、虎杖、大黄3种中药水提物中游离蒽醌含量,比较3种中药水提物对人肝祖细胞Hepa RG的体外细胞毒作用,探讨何首乌、虎杖、大黄中游离蒽醌含量与肝细胞毒性的关系。方法:煎煮法制备何首乌、虎杖、大黄3种受试饮片水提物,采用高效液相色谱色谱法分别同步测定3种水提物中5种主要游离蒽醌大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚的含量;分别以浓度为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/m L的3种中药水提物溶液处理Hepa RG细胞48 h后,加入噻唑兰检测其活力;分别以1.5、2.0、2.5 mg/m L的3种中药水提物溶液处理Hepa RG细胞48 h后,AnnexinⅤ/PI双染后流式细胞术检测凋亡细胞比例。结果:何首乌水提物中主要游离蒽醌含量为0.229%,虎杖水提物中为0.545%,大黄水提物中为2.593%;何首乌水提物(2.0、2.5、3.0 mg/m L)、虎杖水提物(1.5、2.0、2.5、3.0 mg/m L)、大黄水提物(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/m L)均可抑制Hepa RG细胞活力,且抑制程度与主要游离蒽醌含量呈正相关;细胞凋亡实验结果表明,3种中药水提物(1.5、2.0、2.5 mg/m L)均明显诱导Hepa RG细胞凋亡,且凋亡率与主要游离蒽醌含量呈正相关。结论:3种中药水提物中主要游离蒽醌含量由低到高依次为何首乌、虎杖、大黄,该含量与其体外肝细胞毒性作用成正相关,提示游离蒽醌可能是3种中药产生肝细胞毒性的重要成分。     

何首乌水提物及其主要成分对人肝细胞L02中CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1 mRNA表达的影响

目的分析何首乌水提物中主要化学成分及其量,阐明何首乌水提物及其主要成分对人正常肝实质细胞L02中CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1 mRNA表达的影响。方法 HPLC测定何首乌水提物中主要化学成分及其质量分数;MTT法确定何首乌水提物及其主要成分对L02细胞活力的影响;实时荧光定量PCR测定L02细胞中CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1mRNA表达量。结果何首乌水提物主要含有二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素和大黄素甲醚,各成分在何首乌水提物中的质量分数分别为(1.14±0.03)%、(0.106 9±0.001 6)%、(0.010 8±0.000 9)%、(0.003 55±0.000 19)%;何首乌水提物及其主要成分作用L02细胞24 h,何首乌水提物和大黄素对细胞活力的影响随着药物浓度的增加抑制作用增强,IC50值分别为7.290 mg/m L和0.082 mmol/L,二苯乙烯苷、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素甲醚在实验浓度范围内对细胞活力的抑制作用不明显;何首乌水提物、大黄素均可明显抑制L02细胞中CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1 mRNA的表达;大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷抑制CYP1A2和CYP2C9的mRNA表达;二苯乙烯苷抑制CYP1A2 mRNA表达,但激活CYP2C9mRNA表达;大黄素甲醚浓度依赖性抑制CYP1A2、CYP2C9 mRNA表达,却表现低浓度抑制、高浓度激活CYP2E1 mRNA表达。结论何首乌水提物抑制L02细胞中CYP1A2、CYP2C9和CYP2E1 mRNA表达是其所含各种成分综合作用的结果,何首乌4种主要成分均可抑制CYP1A2 mRNA表达,蒽醌成分是抑制CYP2C9 mRNA表达的主要成分,游离蒽醌是抑制CYP2E1 mRNA表达的主要成分。     

斑蝥素及去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的细胞 …

目的 研究抗癌药物斑蝥素及去甲斑蝥素诱导人红白血病Ｋ５６２细胞凋亡细胞学变化特点。方法 观察药物作用后Ｋ５６２细胞开矿的动态变化、一般及超微结构特征,并用流式细胞术分析斑蝥素及去甲斑蝥素诱导Ｋ５６２细胞凋民细胞周期的关系。结果 ２ｍｇ／Ｌ斑蝥素任用４h,部分Ｋ５６２细胞质膜突起,染色质异常凝集,原位复染显示这些细胞质膜 的通透性没有增强,ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳呈现细胞凋亡特有的“梯子”状带纹。电镜下。     

何首乌提取物对人正常肝细胞L02周期阻滞及凋亡的影响

目的：分析何首乌中致人肝细胞损伤物质的化学成分,初步探讨其致肝细胞损伤的机制。 方法：生、制何首乌用70%乙醇提取,提取物经AB-8型大孔树脂吸附分离,依次用水、50%乙醇和95%乙醇洗脱得到生何首乌和制何首乌水洗脱物、50%乙醇洗脱物和95%乙醇洗脱物;生、制何首乌直接水煎煮得到水提物。体外培养人正常肝细胞L02,用含何首乌洗脱物和水提物的细胞培养液与细胞共同孵育一定时间后,检测药物对L02细胞生长的影响,筛选致肝细胞损伤成分。高效液相色谱法对有明显细胞毒作用的洗脱物进行成分分析,噻唑蓝法检测其对L02细胞增殖的影响,Giemsa染色进行形态学观察,流式细胞术检测L02细胞周期和凋亡情况。 结果：生、制何首乌95%乙醇洗脱物对L02细胞有明显的生长抑制作用,其他组分对L02细胞的增殖无明显影响。成分分析显示,生、制何首乌95%乙醇洗脱物中大黄素含量最多,分别为（18.53±2.96）%和（10.28±1.34）%;何首乌95%乙醇洗脱物及大黄素可使L02细胞阻滞于S期,并诱导L02细胞凋亡。 结论：何首乌95%乙醇洗脱物是何首乌中导致肝细胞损伤的主要物质,而大黄素是导致肝细胞损伤的成分之一。     

人尿源性干细胞的原代培养

目的：建立一种人尿源性干细胞（hUSCs）的原代分离培养及保存方法,为hUSCs的应用奠定基础。方法：取10例成人健康志愿者的尿液分别进行hUSCs原代培养,台盼蓝染色法比较不同冻存液配方复苏后的细胞存活率,进而确定hUSCs的最佳冻存液配方;采用四甲基噻唑蓝（MTT）法检测hUSCs细胞的增殖活性;流式细胞术测定间充质干细胞表面抗原CD44和CD90的表达情况。结果：10例健康成人志愿者中6例成功提取了hUSCs并体外培养形成集落;台盼蓝染色法确定配比为DMSO∶FBS∶hUSCs培养基=1∶4∶5的冻存液细胞存活率最高,与其他组比较差异具有统计学意义（P < 0.05）;MTT法检测显示hUSCs生长曲线呈S形且具有良好的增殖活性;流式细胞术鉴定干细胞表面抗原CD44和CD90呈阳性表达。结论：成功建立了一种人尿源性干细胞的原代分离培养及保存方法。     

消核片相关肝损害的国内文献回顾与分析

目的：调查消核片相关肝损害的临床特点及发生原因,为临床合理用药提供参考。方法：以＂消核片＂为检索词,检索《CHKD期刊全文数据库》（1994-2009）,《中国生物医学文献数据库（CBM）》（1978-2009）,收集分析消核片相关肝损害的病例报告。结果：共收集到194例,均为女性患者,年龄17～55岁。68例标明用药剂量,2～7片/次,3次/d,用药时间为14～180d。患者用药50d左右出现恶心、腹胀等消化道症状;用药30～141d出现皮肤、巩膜黄染;生化检查示：丙氨酸转氨酶（ALT）68～1700U/L;天冬氨酸转氨酶（AST）40～1260U/L;总胆红素（TBil）8.0～795.4μmol/L;直接胆红素（DBil）2.3～391.8μmol/L。194例中有10例行肝组织病理检查,呈不同程度的肝细胞肿胀、胞质疏松、气球样变及肝细胞坏死。大多数患者在停药后10d至4个月内逐渐恢复正常,其中190例（97.9%）临床痊愈,3例（1.5%）好转,1例（0.5%）急性肝衰竭患者死于感染性休克。结论：消核片可引起肝损害,多为可逆性;其发生可能与用药剂量及疗程有关;肝病患者应避免使用该药;用药过程中应密切监测肝功能。     

去甲斑蝥素对体外微管蛋白聚合的抑制作用

目的探讨去甲斑蝥素(NCTD)对微管蛋白聚合-解聚过程的影响。方法采用蛋白凝胶电泳鉴定从猪脑中提取的微管蛋白,并用Bradford法测定微管蛋白含量。在经过秋水仙碱和紫杉醇验证稳定的37℃和4℃平衡体系内加入NCTD 10,20和30μmol.L-1观察微管蛋白聚合-解聚活性。人卵巢癌SK-OV-3细胞加入NCTD 60μmol.L-1作用8 h,取上清和沉淀,Western印迹法检测微管蛋白含量。结果与空白对照组相比,在37℃聚合反应中,NCTD 10,20和30μmol.L-1组对微管蛋白聚合的抑制率分别为(5.5±2.7)%,(7.1±1.2)%和(27.5±0.4)%,在此浓度范围内NCTD随浓度的升高抑制作用增强(P<0.05),但对微管蛋白在4℃的解聚影响不显著。NCTD 60μmol.L-1作用人卵巢癌细胞后,细胞中游离微管蛋白增加了(91.5±8.5)%,聚合微管蛋白量减少了(51.8±3.8)%,说明NCTD抑制了人卵巢癌细胞SK-OV-3中微管蛋白的聚合。结论 NCTD对体外微管蛋白的聚合具有一定的抑制作用。     

口服何首乌制剂用药前后肝功能变化分析

目的研究临床常规使用含何首乌汤剂及中成药患者用药前后肝功能指标变化,分析其临床应用的肝损伤风险。方法收集35例临床使用含何首乌汤剂或中成药患者的一般资料,并对患者用药前后谷丙转氨酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转肽酶(GGT)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)和间接胆红素(IBIL)等指标进行检测,根据用药前7项肝功能检测指标正常与否将患者分为2组,分析用药前后2组别患者有无肝功能损伤。结果用药前7项肝功能检测指标正常组患者,用药后AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL和IBIL均值变化差异无统计学意义(P>0.05),ALT均值变化差异有统计学意义(P<0.05),但均在正常值范围内;用药前7项肝功能检测指标不正常组患者,用药后ALP、GGT、TBIL和IBIL均值变化差异无统计学意义(P>0.05),但用药后部分肝功能指标均值有所下降。结论临床常规服用含何首乌汤剂或中成药较为安全,肝损伤风险较小。