进入疟疾研究的后基因组时代

恶性疟原虫基因组测序有望带来疟疾研究方法的革命。除了简单的基因发现,基因组测序将便于综合鉴定寄生虫发育阶段的基因表达、病理以及对药物治疗的宿主遗传背景等环境变量的反应。本文介绍了恶性疟原虫基因组测序计划的近况及功能基因组学开发的生物信息学及其分析工具的应用,其目的是根据对疟原虫生物学的深入观察,确定合理的、基于信息的、新的治疗策略和目标。     

恶性疟原虫FCC1/HN株己糖激酶基因的扩增、克隆和序列分析

目的 扩增恶性疟原虫FCC1／HN株的己糖激酶(HK)编码基因,构建其原核和真核表达重组质粒,测定其序列,比较它及它推导的蛋白质与恶性疟原虫其他株和人之间的差异。 方法 用PCR方法从FCC1／HN株基因组中扩增HK基因;将它分别定向克隆到原核表达质粒pET-30a( )和真核表达质粒pcDNA3,分别转化大肠埃希菌BL21／DE3和JM109感受态细菌;经酶切、PCR扩增鉴定筛选到阳性重组克隆,用双脱氧链末端终止法测定其序列,用生物信息学软件分析HK序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1／HN株HK基因,大小为1482 bp,编码493个氨基酸。其氨基酸序列与3D7株完全相同,与K1株的同源性高达99.8％,但与人的4型HK的同源性只有23.2％~26.6％。 结论 获得恶性疟原虫FCC1／HN株的HK基因,成功构建了其原核和真核表达质粒,并测定了其序列;恶性疟原虫的HK在不同的分离株间高度保守,但与人的同源性很低,可能是一个潜在的药物靶标。     

恶性疟原虫FCC1/HN株CTP基因真核表达载体的构建

目的构建恶性疟原虫CTP 基因的真核表达载体,以便进一步研究其功能. 方法根据Genbank 已发表恶性疟原虫CTP基因序列(序列号为X084041),自行设计并合成了一对引物,通过聚合酶链反应扩增出CTP基因,经HindⅢ和BamHⅠ消化后定向克隆入测序载体pUC19,构建重组质粒pUC19-CTP.经双酶切、PCR扩增和序列测定,证实插入片段与已知CTP编码序列完全相同.用HindⅢ和BamHⅠ消化pUC19-CTP,将双酶切下的CTP编码基因片段定向亚克隆入真核表达载体pcDNA3. 结果经双酶切和PCR扩增鉴定证实CTP基因正向插入真核表达载体pcDNA3中. 结论真核表达质粒pcDNA3-CTP构建成功.     

日本血吸虫乳酸脱氢酶(SjLDH)结构与功能的生物信息学分析

目的 应用生物信息学分析软件预测日本血吸虫乳酸脱氢酶（SjLDH）氨基酸序列的结构与功能。 方法 应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及Vector NTI、PCgene等软件包分析SjLDH与其他物种的同源序列，进行多序列同源比对，分析相同的保守位点及催化活性位点，构建分子进化树；预测二级结构、拓扑结构；同源模建预测三级结构；预测主要抗原表位等。 结果 SjLDH与其他物种的同源序列含相同的保守位点及催化活性位点，与华支睾吸虫LDH（CsLDH）同源性最高为75％，与阴道毛滴虫LDH（TvLDH）同源性最低为17%，与人LDH（HsLDH-A，-B，-C）的同源性为58%~60％； SjLDH与果蝇（DmLDH）的进化距离较秀丽隐杆线虫（CeLDH）为近，3种人LDH中与HsLDH-B、-C的进化距离较HsLDH-A为近；该蛋白具有3个跨膜区域，3个高亲水性区域，主要的线性表位98aa~106aa位于膜外，与原虫LDH相同区域差异显著，而与其他LDH有1~3个氨基酸的差异，关键催化位点之一及底物丙酮酸结合区域位于该区域，蛋白质同源模建分析表明该区域位于蛋白表面形成环状结构，3个关键催化位点位于该区域或在其附近。 结论 生物信息学预测结果提示LDH是研究物种分子进化理想的分子；SjLDH可能是免疫诊断、药物作用及疫苗潜在的靶分子。     

华支睾吸虫溶血磷脂酶基因的识别、克隆和序列分析

目的　筛选cDNA文库识别华支睾吸虫新基因 ,并将所发现的华支睾吸虫溶血磷脂酶 (csLysoPLAH)基因编码区克隆到原核表达质粒PGEX 4T 1和真核表达质粒pcDNA3上 ,为进一步研究其功能奠定基础。　方法　对华支睾吸虫cDNA文库进行随机筛选并测序 ,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析 ,识别华支睾吸虫新基因 ,并应用Motifsan、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行结构域分析。根据PGEX 4T 1和 pcDNA3上的克隆位点及所发现的csLysoPLAHcDNA编码序列设计引物 ,进行PCR扩增 ,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX 4T 1和真核表达载体 pcDNA3上。构建的PGEX 4T 1 csLysoPLAH、pcDNA3 csLysoPLAH重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。　结果　发现csLysoPLAH基因 ,完整阅读框含 70 8个碱基 ,编码 2 3 5个氨基酸 ,理论分子质量为 2 5 .2 62 8ku ,理论pI为6.0 3。序列分析表明 ,csLysoPLAH编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性 ,csLysoPLAH具有磷脂酶 /羧酸酯酶保守功能域和完整的脂酶保守功能域 ,并含有丝氨酸酯酶特征性的标签肽 (即GXSXG)。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。　结论　发现华支睾吸虫溶血磷脂酶基因 ,并成功构建原核和真核重组表达质粒。     

反向疫苗技术在感染性疾病疫苗研发中的应用

反向疫苗技术是指利用基因组序列信息和生物信息学技术,快速识别和鉴定疫苗候选分子的一种新型疫苗研制技术.该技术已被成功用于筛选B型脑膜炎双球菌疫苗候选抗原,且在其他重要的人体病原体疫苗候选分子的筛选中也得到了成功的应用,提示反向疫苗技术在新型疫苗研发中具有广阔的应用前景.     

弓形虫表面抗原SAG3基因片段克隆及序列测定

目的 克隆弓形虫ZS2及RH株SAG3表面抗原基因片段，并进行序列分析。方法 设计合成引物，从弓形虫ZS2、RH及ZS1株基因组DNA中分别特异扩增出编码SAG3抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRⅠ和BamH Ⅰ双酶切后，克隆到原核表达质检pGEX-47-2中，转化入大肠杆菌JMl09，用PCR初筛，将PCR扩增阳性的重组子用EooRⅠ和BamH Ⅰ双酶切鉴定，并进行序列的测定。结果 从弓形虫ZS2、RH和ZS1株DNA中扩增出1176bp的SAG3基因，构建重组质检pGEX-47-2-SAG3(pGEX—SAG3)，酶切产物的大小分别与预期相符。结论 成功地对弓形虫ZS2、RH和ZS1株SAG3基因进行体外扩增及构建原核表达重组质检pGEX-SAG3，并经酶切及序列分析所验证，为弓形虫SAG3表面抗原的表达、体外诊断研究做好准备。     

日本血吸虫精氨酸酶新基因的鉴定及作为疫苗的保护性研究

目的 识别和鉴定日本血吸虫（Sj）精氨酸酶（ARG）新基因，并研究纯化的重组SjARG对Sj感染小鼠的保护性。　方法 通过巢式PCR，从日本血吸虫尾蚴cDNA文库特异扩增ARG基因cDNA序列的5′端，并用生物信息学进行鉴定；将ARG的完整编码序列（CDS）克隆到pET30a（+）载体，表达并纯化表达产物后，以鸟氨酸-茚三酮法鉴定酶活性；用蛋白质印迹法（Western blotting）比较重组ARG蛋白与Sj天然ARG蛋白的免疫学特性，间接免疫荧光法对ARG在Sj成虫中的分布进行组织定位；用纯化重组ARG蛋白免疫小鼠（PBS和SjGST作对照），Sj尾蚴攻击感染后，检测SjARG作为疫苗的免疫保护力。 结果 　扩增并鉴定SjARG基因的完整CDS长为1 095 bp；重组SjARG具有酶活性，并具有与Sj天然ARG蛋白相同的免疫学特性；ARG定位于Sj成虫的肠壁和生殖器官。重组SjARG蛋白免疫后的减虫率和减卵率分别为55.8%和48.8%。SjGST蛋白免疫后的减虫率和减卵率分别为28.6%和6.89%。 结论 获取并鉴定了SjARG新基因；SjARG比SjGST具有更高的疫苗保护性。     

鄱阳湖血吸虫病重疫区居民病情调查结果分析

目的：通过对血吸虫病重疫区居民病情的分析，探讨Ｂ超在评估血吸虫病病情中的应用价值。方法：对江西省鄱阳湖区某血吸虫病重疫区村居民进行病原学检查、病史询问及Ｂ超检查，分析不同年龄、性别、职业人群Ｂ超图像异常比例及与血吸虫感染和病史的关系。结果：居民血吸虫粪检阳性率２２．９％，肝实质Ｉ级及以上（血吸虫病肝纤维化）的比例为２２．０％。各项Ｂ超检查指标异常比例男性高于女性，高年龄组高于低年龄组。多因素非条件Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归分析表明，性别为多项Ｂ超检查指标异常的危险因素，而肝实质异常的危险因素有年龄、性别、职业、血吸虫感染与否及治疗次数。结论：Ｂ超可以直接反映居民肝、脾损伤，但由于血吸虫病肝纤维化的产生是个体长期感染的累积，寻找反映早期病变的敏感指标仍是Ｂ超应用于病情评估中有待解决的问题。     

广州市2010年登革4型病毒的分离及其E基因进化分析

登革病毒(DEN)E蛋白在病毒与宿主细胞融合和诱导机体产生抗体等过程中发挥重要作用[1].本研究通过对分离株E基因全序列测定,从分子水平确定其型别,并与广州市历年同型DEN流行株及相关国际流行株进行同源性比较,构建系统进化树,追踪其可能输入来源.