α2－巨球蛋白活性检测方法的建立与优化

目的：建立α2－巨球蛋白（α2－macroglobulin ,α2－M）活性检测方法,检测Cohn组分Ⅳ中α2－M的活性。方法α2－M可与胰蛋白酶相互作用形成“α2－M－胰蛋白酶复合物”,利用酶标仪检测出“α2－M－胰蛋白酶复合物”与小分子底物Na－苯甲酰－DL－精氨酸－对硝基酰胺盐酸盐（ Na－benzoyl－DL－arginine 4－nitroanilide hydrochloride ,BAPNA）显色反应后的光密度值（410 nm）,根据建立的血浆α2－M活性标准曲线,定量计算出Cohn组分Ⅳ浓缩液中α2－M的活性。结果通过对实验体系中几个关键实验条件进行优化,建立了血浆α2－M活性标准曲线,并计算出Cohn组分Ⅳ浓缩液中α2－M活性的平均值为1．578 PU／ml。结论以正常人混合血浆作为参考标准品,用发色底物法检测Cohn组分Ⅳ浓缩液中α2－M的活性,方法简便易行,为α2－M制备过程中活性测定提供了实验基础。     

胰蛋白酶在猪慢性胰腺炎胰腺组织中的分布及免疫组化阳性标准

目的:建立慢性胰腺炎(CP)胰蛋白酶免疫组化阳性判断标准,探讨胰蛋白酶在CP中的分布特征及与CP严重程度的关系.方法:取正常猪4例及不同程度CP猪14例的胰腺组织,用链菌素亲生物素-过氧化酶连接法(streptavidin peroxidase conjugated method,SP)免疫组化法检测胰蛋白酶在实验性CP胰腺组织中的分布特征并初步建立阳性判断标准,分析胰蛋白酶的阳性标准与CP严重程度的相关性.结果:胰蛋白酶在CP胰腺组织主要表现为腺泡细胞质内、间质及胰管内棕色或棕黄色染色,染色程度在轻度CP以强阳性( )为主,中度CP以中等阳性( )为主,重度CP以弱阳性(±)为主,3组染色程度之间差异有统计学意义(P<0.05).胰蛋白酶强阳性染色与慢性胰腺炎严重程度具有相关性(r=0.742).结论:胰蛋白酶原异常活化可见于腺泡细胞质内、间质及胰管内,建立了胰蛋白酶阳性判断标准.随着慢性胰腺炎实质纤维化,胰蛋白酶阳性率降低.     

聚山梨酯80对多源肥大细胞脱颗粒的影响研究

目的 通过比较不同浓度聚山梨酯80溶液对RBL-2H3、P815、Ku812细胞脱颗粒的影响,探究聚山梨酯80的量与过敏反应的关系,进而筛选出一套灵敏、稳定的体外肥大细胞脱颗粒模型。方法 体外培养RBL-2H3、P815和Ku812细胞,测定3株细胞的生长曲线,在细胞生长对数期,以不同浓度（0.04、0.20、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 mg/mL）聚山梨酯80分别刺激3株细胞,采用中性红染色法显微镜下观察不同浓度聚山梨酯80溶液对3株细胞脱颗粒的影响,并计算脱颗粒百分率,同时以化学发光法分别检测组胺和β-氨基己糖苷酶释放率,以酶联免疫吸附法测定类胰蛋白酶的释放量;并进一步检测聚山梨酯80对人的肥大细胞IgE释放的影响。结果 3株肥大细胞脱颗粒模型中,各细胞的脱颗粒指标均随聚山梨酯80浓度的升高而升高。相同浓度聚山梨酯80对人源、大鼠、小鼠肥大细胞的类胰蛋白酶释放量无较大统计学差异;与RBL-2H3细胞系比较,P815细胞和组胺释放率显著降低（P<0.05、0.01）,Ku812细胞组胺释放率和β-氨基己糖苷酶释放率显著升高（P<0.05、0.01）,Ku812细胞脱颗粒最灵敏。但在实验过程中发现Ku812细胞模型稳定性、可重复性较差,而RBL-2H3细胞稳定性、可重复性均优于Ku812和P815细胞。0.04~80.00 mg/mL的聚山梨酯80溶液作用于Ku812细胞产生的IgE均低于检测限。结论 聚山梨酯80诱导的过敏反应可能是不经过IgE介导的类过敏反应,随着聚山梨酯80浓度的增大,3个细胞模型脱颗粒现象显著,相比于Ku812和P815细胞,RBL-2H3细胞更适合作为体外肥大细胞脱颗粒检测模型。     

肥大细胞和蛋白酶激活受体-2表达在胃食管反流病中的意义

背景:既往研究显示食管黏膜暴露于酸或胆汁引起的肥大细胞(MC)脱颗粒释放炎症介质以及蛋白酶激活受体-2(PAR-2)相关通路参与了胃食管反流病(GERD)的发病机制。人MC上可能存在PAR-2,但尚未见两者在GERD中关系的报道。目的:研究GERD患者食管黏膜上皮中的MC数量和PAR-2表达情况以及其间的相关性,明确两者在GERD发病中的意义。方法:以免疫组化方法检测30例糜烂性食管炎(EE)、32例非糜烂性反流病(NERD)以及20例正常对照者食管黏膜上皮中的MC数量和PAR-2表达。结果:EE组和NERD组类胰蛋白酶阳性MC数量和PAR-2表达强度均明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01),EE组与NERD组间差异无统计学意义。EE组和NERD组中的MC数量均与PAR-2免疫组化评分呈正相关(r=0.875,P<0.01;r=0.884,P<0.01)。结论:GERD患者食管黏膜上皮中的MC数量增多、PAR-2表达上调且两者呈正相关。推测MC表面的PAR-2活化可激活MC脱颗粒,而MC释放的类胰蛋白酶又可激活PAR-2,两者共同参与了GERD的发病机制。     

免疫层析法检测尿胰蛋白酶原—2

用免疫层析法测定了112例急腹症病人尿胰蛋白酶原-2,旨在探讨尿胰蛋白酶原-2对急性胰腺炎的早期诊断价值,结果报告如下.     

快速检测尿胰蛋白酶原-2在急性胰腺炎诊断中的意义

目的　探讨快速检测尿胰蛋白酶原 2在急性胰腺炎诊断中的意义。方法　收集 347例急腹症患者血清和尿液标本 ,分别测定尿胰蛋白酶原 2和血、尿淀粉酶 (AMS)活性 ,并将结果进行比较。结果　尿胰蛋白酶原 2检测对急性胰腺炎诊断的敏感性、特异性分别为 89.3%和 90 .3% ,血AMS为 80 .2 %和 81.9% ,尿AMS为74 .8%和 77.8%。尿胰蛋白酶原 2的敏感性和特异性均显著高于血、尿AMS检测。结论　试纸法快速检测尿胰蛋白酶原 2诊断急性胰腺炎具有较高的精确性 ,是筛选急性胰腺炎简便而快速的方法     

柴黄清胰活血方治疗高脂血症性急性胰腺炎的疗效观察

目的观察柴黄清胰活血方治疗高脂血症性急性胰腺炎的疗效。方法将高脂血症性急性胰腺炎患者86例根据随机数字表法分为对照组(西医综合治疗)与观察组(西医综合治疗基础上联合柴黄清胰活血方治疗)各43例,比较两组患者治疗后的临床疗效。结果观察组患者腹痛缓解时间、首次大便时间、血淀粉酶恢复时间、尿淀粉酶恢复时间均显著短于对照组(P<0.05)。两组治疗3、7 d后血清胰蛋白酶原2(TPG-2)、胰脂肪酶(TGL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-18(IL-18)、血小板膜蛋白-140(GMP-140)、甘油三酯(TAG)水平均较治疗前下降,且观察组各项指标显著低于对照组(P<0.05)。结论柴黄清胰活血方治疗高脂血症性急性胰腺炎可减轻患者炎症反应,改善消化功能指标,降低GMP-140、TAG的表达水平,有效缓解临床症状。     

胰蛋白酶差速脱壁法分离纯化人表皮干细胞

背景：表皮干细胞对于修复皮肤缺损具有重要意义，但如何方便、快捷地对所获取的表皮干细胞进行纯化培养一直没有比较好的技术方法。目的：拟应用胰蛋白酶差速脱壁法去除表皮干细胞中混杂的成纤维细胞。设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2006-06／2007—06在解放军军事医学科学院输血医学研究所干细胞与再生医学研究室完成。材料：实验所用皮肤来源于20～30岁女性乳房缩小整形术患者，由北京协和医院整形外科提供。方法：无菌条件下切取皮肤，剪除皮下脂肪组织，采用胶原酶／Dispase酶和胰蛋白酶两步法体外分离培养表皮干细胞。待细胞生长达70％～80％融合时，加入胰蛋白酶消化尚未脱壁的细胞，30s～1min后吸出脱壁细胞，同法传代培养至第5代细胞。主要观察指标：第1，5代表皮干细胞表面标志CD29、CD49f、CD71的表达。流式细胞仪检测第5代细胞生长周期。免疫荧光检测第5代表皮干细胞和传代时胰蛋白酶消化30s～1min即脱壁细胞角蛋白19及波形蛋白的表达。透射电镜观察表皮干细胞超微结构。结果：第1代表皮干细胞CD29阳性率94．32％，CD49f阳性率86．24％，CD71呈弱阳性，经过4次胰蛋白酶差速脱壁去除混杂细胞后，第5代表皮干细胞CD29阳性率96．77％，CD49f阳性率96131，CD71呈弱阳性，82．58％表皮干细胞处于G0～G1期。第5代表皮干细胞角蛋白19呈阳性，波形蛋白呈阴性，而传代时胰蛋白酶消化脱壁的细胞角蛋白19呈阴性，波形蛋白呈阳性，证实为成纤维细胞。表皮干细胞呈克隆样生长，透射电镜下胞质中可见呈束状排列的角蛋白丝。结论：应用胰蛋白酶差速脱壁法能够简单、有效地获取纯化的表皮干细胞。     

紧密连接蛋白1与重症急性胰腺炎大鼠胰腺微血管损伤关系的实验研究

目的研究重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）大鼠紧密连接蛋白1（ZO-1）随时间的变化及其与SAP微血管损伤和胰腺组织病理学评分的关系。方法将48只Wistar大鼠随机均分为假手术组（SO组）和SAP组。SO组大鼠开腹后仅翻动胰腺;SAP组大鼠开腹后,以逆行胰胆管微泵注射5%牛磺胆酸钠法制备SAP模型。2组大鼠分别于手术后6、12及24 h各处死8只大鼠,取腹主动脉血测定外周血中淀粉酶、胰蛋白酶、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及ZO-1蛋白水平;取胰腺组织行HE染色,观察其病理学变化并评分;同时行免疫组化染色检测ZO-1蛋白的表达情况。结果同时点与SO组比较,各时点SAP组的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平均较高（P〈0.05）。SAP-6 h组和12 h组的血清淀粉酶水平均低于24 h组（P〈0.05）;SAP组内大鼠的胰蛋白酶、IL-8和ZO-1蛋白水平均随时点延长逐渐升高,各时点组间两两比较差异均有统计学意义（P〈0.05）;SAP组内3个时点组间TNF-α水平的差异无统计学意义（P〉0.05）。多重线性回归模型结果显示,SAP组血清ZO-1蛋白水平与胰腺组织病理学评分（b=0.96,P〈0.05）、血清淀粉酶水平（b=0.87,P〈0.05）、胰蛋白酶水平（b=0.72,P〈0.05）及IL-8水平（b=0.69,P〈0.05）均呈正相关,而与TNF-α水平的关系无统计学意义（P〉0.05）。HE染色结果显示,各时点SAP组大鼠的胰腺组织损伤程度重于SO组,且随时间延长,SAP大鼠胰腺组织的病理学损伤加重;SAP-12 h组和24 h组的胰腺组织病理学评分均高于6 h组（P〈0.05）。SP免疫组化染色结果显示,随时间延长,SAP组大鼠胰腺腺泡细胞间及毛细血管壁的ZO-1蛋白颗粒数量减少,且在毛细血管中的表达不连续。结论在SAP的进程中,血清中ZO-1蛋白的水平上升,同时其在胰腺组织中的表达呈下调趋势,表明其与SAP时的胰腺微血管损伤有关。     

自噬在急性胰腺炎发生发展中的作用

急性胰腺炎是胰酶提前激活造成胰腺及周围组织自身消化的一种急性炎症性疾病,自噬作为细胞清除异常物质的一种方式,出现在急性胰腺炎的早期病理过程中,其中自噬过程受损是其关键病理反应。自噬受损、组织蛋白水解酶失调、自噬调节异常提示自噬在急性胰腺炎中发挥重要作用。针对自噬形成、自噬与酶原激活、自噬受损与急性胰腺炎及自噬缺陷促进炎症发展等方面对自噬在急性胰腺炎中的作用进行探讨。