汉族肥胖儿童黑皮质素4受体基因筛查

目的探讨肥胖儿童黑皮质素4受体(MC4R)的突变频率及其与临床生化指标改变的关系。 方法浙江大学医学院附属儿童医院等单位于2004—2005年，对200例肥胖及100例正常体重儿童，利用PCR及基因测序技术进行MC4R基因筛查，同时对200例肥胖儿童进行生化检测和口服葡萄糖耐量试验。 结果(1)200例肥胖儿童中检出杂合子错义突变、无义突变3例；100例对照组中未检出突变;Val103Ile基因多态性在两组中分别有6例、2例。肥胖组中发现了3个新的杂合子突变位点Val166Ile、Cys277Stop、Arg310Lys；肥胖组和对照组中同时检测到新的杂合子变异Leu23Arg。(2)MC4R突变组和非突变组的肥胖儿童BMI、ALT、AST、TG、CHO、WBISI比较均无统计学意义(P>0.05)。 结论(1)首次在汉族儿童人群中发现了MC4R基因3个新的杂合子突变位点(Val166Ile、Cys277Stop、Arg310Lys)。(2)Leu23Arg可能是汉族人群MC4R的基因多态性。     

江苏汉族人群心脑血管病患者载脂蛋白E基因研究

目的:探讨用基因测序法检测载脂蛋白E(ApoE)基因多态性及其与心脑血管疾病之间的关系。方法:应用基因测序方法检测了193例心脑血管疾病患者和100例无血缘关系的健康汉族人群ApoE基因型。结果:ε3/3基因型高血压组频率为64.3%,高血压 冠心病组为57.7%,高血压 脑血管病组为62.2%均明显低于对照组的86%(P<0.05);而ε3/4基因型频率,高血压组为21.4%,高血压 冠心病组为19.2%,高血压 脑血管病组为24.4%,均显著高于对照组的6%(P<0.05);ε4/4基因型高血压 冠心病组频率为5.1%明显高于对照组0%(P<0.05)。分析等位基因频率,高血压组和高血压 冠心病组、高血压 脑血管病组ε3等位基因频率分别为80.7%,74.4%和78.9%,明显低于对照组92.5%(P<0.05),ε4等位基因频率分别为12.1%,16.7%和14.5%,明显高于对照组的3.5%(P<0.05),差异有明显统计学意义。两组间其它各基因型无统计学差异。结论:应用基因测序方法进行ApoE基因分型是最全面、最直接、可靠的方法;ε4等位基因是心脑血管疾病共同的遗传易患因子,而ε3等位基因具有保护作用。     

P4501A1基因Thr~(461)→Asn~(461)及Ile~(462)→Val~(462)突变载体的构建

目的构建P4501A1基因cDNAThr461→Asn461及Ile462→Val462突变载体,为进一步研究CYP1A1的功能和致癌机制奠定基础。方法根据人CYP1A1基因(GeneBankNM-000499)cDNA序列设计通用引物Pm3/Pm4和突变引物Pt15/Pt16;Pt17/Pt18,内含酶切位点和突变位点,先用Pm3/Pt16,Pm3/Pt18组成两对引物,以pGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第一轮扩增,获得上游1397bp片断,再用Pt15/Pm4,Pt17/Pm4组成两对引物以10ngpGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第二轮扩增,得到下游177bp片断。然后用Pm3/Pm4做引物以第一、第二轮扩增产物为模板进行第三轮扩增,获得的1·5kb扩增产物用1%琼脂糖凝胶分离并回收纯化,将纯化的PCR产物与pMD-T载体连接后转化大肠埃希菌DHα5感受态细胞,挑单克隆扩增、质粒抽提后进行酶切和测序鉴定。结果三轮PCR扩增得到的1·5kb片断,经内切酶BamHI和SalI消化和T7p和SP6通用引物进行双向测序,证实克隆的目的片段与GeneBank中人CYP1A1基因cDNA的序列同源性为99·9%,且包含两个设计的突变位点Asn461、Val462。结论本实验成功地构建了含突变位点Asn461、Val462的CYP1A1基因cDNA的片断。     

重亚硫酸盐修饰直接测序技术检测p16基因甲基化的研究

目的建立稳定的重亚硫酸盐直接测序技术，检测p16基因甲基化状况。方法提取正常人全血基因组DNA．建立起稳定的重亚硫酸盐直接测序平台，利用该技术检测结直肠癌细胞株pl6基因甲基化状况。结果应用列联表的Fisher，Exact Test比较3种纯化方法的测序结果，乙醇／醋酸钠和过柱纯化与SAP—ExonI纯化法比较，测序结果差异有统计学意义（P〈0．05）；应用重亚硫酸盐直接测序技术，可检测出p16基因目的片段中CpG岛所有CpG位点的甲基化状况。结论应用SAP—ExonI纯化法，建立了稳定的重亚硫酸盐直接测序技术，并可检测出目的片段中CpG岛所有CpG位点的甲基化状况。     

60株肺炎克雷伯菌多重耐药性及主要耐药基因的研究

目的：了解临床分离的肺炎克雷伯菌耐药性及主要耐药基因存在状况。方法：采用Micmsean微生物鉴定仪，微量肉汤稀释法测定肺炎克雷伯菌对21种抗生素的敏感性。采用聚合酶链反应(PCR)及测序技术分析超广谱B内酰氨酶(ESBLs)，质粒介导的AmpC酶和氨基糖苷类修饰酶基因型。结果：肺炎克雷伯菌对亚胺培南全部敏感，对其他抗生素均有不同程度的耐药。60株全部扩增出TEM基因，有25株检出CTX-M-I群基因，有54株扩增出DHA基因，59株检出共3种氨基糖苷类修饰酶基因。且有22株同时携带2～6种耐药基因。对其中4株细菌进行基因型测序，证实CTX-M-I群扩增产物均为CTX-M-3；DHA扩增产物均为DHA-1；氨基糖苷类修饰酶基因分别为aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-I和ant(3″)-I。其中CTX-M-3(AY635141)、DHA-1(AY635140)已注册GenBank(括号内为GenBank注册号)。结论：临床分离的肺炎克雷伯菌为多重耐药菌，同时存在2～6种耐药基因。     

基于化学成分与肠道菌群探讨消癌解毒方中黄连-乌梅药对的配伍机制

目的 探讨黄连-乌梅药对与消癌解毒方水煎液中部分生物碱类成分的含量差异,并比较药对与全方对小鼠肠道菌群的影响。方法 采用Extend-C₁₈(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色谱柱,以0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）进行梯度洗脱,流速0.3 mL/min,柱温35 ℃,进样量2 μL;离子化模式为电喷雾离子化（ESI）,以正离子模式检测,开展方法学验证和含量测定研究。按照给药不同将小鼠分为正常组、全方高浓度组、全方低浓度组、药对高浓度组和药对低浓度组,连续灌胃给药7 d,每组分别收集粪便样本,进行16S rRNA基因测序。结果 建立的含量测定方法在一定浓度范围内线性关系良好,方法学验证结果均符合相关要求,木兰花碱与非洲防己碱在黄连、药对以及全方中的含量分别为:(4.433±0.133)(8.905±0.154) mg/g,（3.545±0.033）（9.170±0.051） mg/g,（5.287±0.038）（13.861±0.690） mg/g。全方组和药对组中拟杆菌门Bacteroides的丰度均高于正常组,而全方组和药对组中厚壁菌门Firmicutes的丰度均低于正常组。药对高浓度组中的疣微菌门Verrucomicrobia和变形菌门Proteobacteria的丰度高于其他组。结论 液质联用方法和相关参数简便、可靠,可用于有关成分的含量检测。与单味药中含量相比,经过药对配伍后,非洲防己碱含量增加,而木兰花碱含量则略有降低;经过全方配伍后,2种成分的含量均增加。此外,肠道菌群实验表明无论是药对还是全方在给药后,会不同程度地影响肠道菌群内部占比改变,其可能对调节肠道系统平衡,具有一定帮助作用,从而为进一步阐释黄连-乌梅在消癌解毒方中配伍机制提供了参考和依据。      

PIK3CD基因突变致PI3K-δ过度活化综合征1例报告并文献复习

目的了解PI3K-δ过度活化综合征的临床特征及致病基因。方法回顾分析1例PI3K-δ过度活化综合征患儿的临床资料。结果患儿,男,3岁10个月,反复呼吸道感染,肝脾肿大,发育落后。提取患儿及父母外周血DNA,通过全外显子组测序及Sanger验证,证实患儿PIK3CD基因存在错义变异c.3061GA(E1021K),先证者父母PIK3CD基因均未发现上述变异,为新生变异。该突变使PIK3CD基因发生功能获得性突变,导致编码的p110δ活性增强,PI3K-PIP3-AKT-mTOR信号通路过度激活,诱导细胞分化增殖,致疾病发生,为致病性突变。结论 PI 3 K-δ过度活化综合征为罕见的常染色体显性遗传免疫缺陷病,基因检测可协助诊断。     

高胰岛素血症伴高氨血症综合征1例报告并文献复习

目的探讨GLUD1基因变异所致高胰岛素血症伴高氨血症综合征临床表现和致病基因特点。方法回顾分析1例高胰岛素血症伴高氨血症综合征患儿的临床资料,并复习相关文献。结果女性患儿,1岁9个月起病,反复出现血糖偏低2年余,并惊厥发作3次,给予升血糖、止惊对症处理后可缓解;伴血胰岛素、血氨水平升高,诊断为高胰岛素血症伴高氨血症综合征。高通量测序发现患儿GLUD1基因存在错义变异c.965GA,p.Arg322His(杂合),其父母该位点均为正常基因型,为新生突变。结论基因检测有助于明确高胰岛素血症伴高氨血症综合征诊断。     

直接测序法检测结肠癌患者K-ras基因的灵敏度及其临床价值分析

目的 探讨结肠癌患者应用直接测序法测定K-ras 基因的灵敏度及其临床价值。方法 选取我院2016 年2 月~2017 年4 月收治的结肠癌患者80 例，随机分为研究组和对照组两组，研究组患者通过直接测序法、对照组患者通过sanger 测序法检测患者体内的K-ras 基因突变情况，分析K-ras 基因突变率与患者肿瘤大小、肿瘤部位、患者年龄等一般资料之间的相关性。结果 研究组患者测定K-ras 基因突变的灵敏度明显高于对照组（P<0.05），肿瘤直径在5 cm 以上患者的K-ras 基因突变率明显低于直径在5 cm 以下的患者（P<0.05）研究组检出率与患者肿瘤部位及分化程度、患者年龄等存在相关性。结论 应用直接测序法检测结肠癌患者K-ras 基因的突变情况具有较高的灵敏度，直接测序法的检出率与患者的肿瘤大小、肿瘤分化程度以及患者的年龄等存在较强的相关性，对于临床上结肠癌等恶性肿瘤疾病的诊断具有较强的应用价值，值得临床上广泛推荐使用。