差速贴壁法分离兔骨髓源性间充质干细胞和内皮祖细胞及其生物学特性的研究

本研究探讨一种高效、稳定的从兔骨髓中同时分离培养间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSC）和内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells,EPC）的方法并观察其生物学特性。抽取兔骨髓,应用密度梯度分离单个核细胞,采用差速贴壁经纤连蛋白包被并结合EGM-2MV培养基分别扩增MSC和EPC。用台盼蓝法测定细胞传代成活率,通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测MSC和EPC的增殖能力及诱导分化成骨细胞、成脂肪细胞能力,并结合流式细胞术（FCM）检测MSC免疫原型以鉴定MSC;细胞吞噬功能特异性地摄取Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1,并结合CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光鉴定EPC,并计算其纯度。结果表明,经密度梯度分离单个核细胞,在早期贴壁细胞24 h换液时即可见明显集落形成,8 d后达80%融合,细胞呈均匀一致的长梭形排列;2次贴壁细胞经EGM-2MV培养基培养,第3天开始伸展,约8 d可融合近80%,细胞呈多角形,出现条索状结构;2种细胞台盼蓝法测定细胞传代成活率均在90%以上,传至第2代后,生长曲线均近似＂S＂形;MTT法检测显示,细胞生长d 3至d 5时光密度值变化较明显;MSC G0-G1期为（93.32±1.65）%、EPC G0-G1为（93.05±1.95）%,2种细胞DNA周期无明显差异;早期贴壁细胞FCM检测CD90、CD44阳性率为（99.7±1.12）%、（99.1±2.33）%;CD14、CD45、CD79a阳性率分别为（4.8±0.38）%、（6.8±0.49）%及（0.4±0.08）%,经体外诱导能够向成骨细胞及脂肪细胞分化,鉴定为MSC;2次贴壁细胞传至第2代经Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率（82.1±3.4）%,CD133、VEGFR2/KDR、CD34免疫荧光染色阳性率分别为（74.2±3.2）%、（64.7±4.3）%及（43.5±1.5）%,鉴定为EPC。结论：应用密度梯度分离法结合差速贴壁筛选法可培养出高纯度的MSC,2次贴壁细胞经纤连蛋白预包被并结合EGM-2MV培养基体外诱导可培养出增殖能力较强的EPC,为组织工程学研究提供种子细胞。     

中国仓鼠卵巢细胞集落的简易原位贴壁冻存方法

目的：目前通用的细胞冻存方法是将细胞在保护剂的作用下是悬浮冻者，这样细胞自然相互混合，复苏后不能保持原来的位置关系，本工作探索在需要时将中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）在贴壁状态下原位冻存的可能性，方法：将转促红细胞生成素（ＥＰＯ）表达质粒形成的ＣＨＯ集落细胞在贴壁状态下加上１０％的二甲亚砜保护作用，然后分阶段降温并保存在－７０℃冰箱，两个月后复苏检测细胞的存活情况及其目的产物的表达情况，结果：集落至少     

机械应力刺激对培养的人成纤维细胞分泌生长因子的影响

目的：研究单次持续40％幅度的牵拉作用于人皮肤戍纤维细胞后bFGF、TGFD。的表达，初步探讨机械应力作用下细胞增殖的机理。方法：体外培养人正常皮肤成纤维细胞，将细胞转移至牵拉细胞培养模型中的弹性膜上，待细胞贴壁生长至75％～80%融合时，实施40％单次持续牵拉，用WESTERN—BLOT对非牵拉组与牵拉组24h、36h、48h、72h的细胞bFGF、TGFβ1进行检测。结果：牵拉各组及对照组均呈阳性表达，但牵拉48h后两者的表达较未牵拉时明显增加。结论：单次40％持续的牵挂方式可以促进bFGF、TGFβ1表达，可能是导致细胞的增殖。     

小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分离扩增及鉴定

目的:探讨一种简单易行的的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增小鼠BMSCs。观察原代及传代小鼠BMSCs形态变化,对第3代小鼠BMSCs表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106进行流式细胞仪检测。结果:小鼠BMSCs的原代接种培养24h后可见大量悬浮细胞,少许贴壁细胞,呈小圆形;72h后贴壁细胞逐渐增多,培养至第7天细胞伸展成长梭形,呈集落生长。BMSCs在培养的2～6d细胞增殖较慢,7～10d细胞增殖较快。传代后的小鼠BMSCs 24h基本全部贴壁,呈均匀性梭行细胞样生长。流式细胞仪检测结果显示:CD105、CD106表达阳性,表达率分别为92.2%、90.4%;CD34、CD45表达阴性,表达率分别为8.8%、13.1%。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养小鼠BMSCs的理想方案。流式细胞术可以鉴定体外分离培养的小鼠BMSCs。     

旋转式三维细胞培养装置的研制

背景：内皮细胞体外培养形成的单层内皮细胞能否抵抗血流的冲击,如何实现细胞均匀分布生长是实验中的常见问题。目的：针对背景问题,研制一种细胞培养装置,可提供细胞生长的三维环境,实现细胞贴硅胶弹性腔管壁生长,改善细胞的分布不均。方法：从控制单元、机械单元和细胞培养单元介绍了该装置的结构与功能,并利用该装置进行一例脐静脉内皮细胞培养实验。结果与结论：旋转式三维细胞培养装置为细胞代谢提供了一定条件,该装置培养的细胞能贴壁均匀,生长良好。     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的:探讨一种简便可行的兔骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法。方法:通过全骨髓贴壁分离法体外分离、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜观察细胞形态;并向软骨细胞诱导分化,采用番红快绿染色和甲苯胺蓝染色鉴定。结果:经全骨髓贴壁法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长;成软骨诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出软骨细胞的形态特征和生物学特征。结论:采用全骨髓贴壁分离法操作简便,是培养兔骨髓间充质干细胞的理想方案,在适当的条件下BMSCs能多向分化。     

全骨髓贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞体外定向成骨诱导分化及鉴定

背景：流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法对细胞活性影响较大,密度梯度离心法虽然能够获得纯度高的单核细胞,但由于多次离心可造成细胞的大量流失且对细胞活性有一定的影响使其应用值得商榷。目的：采用全骨髓贴壁法分离兔骨髓间充质干细胞进行成骨诱导分化及鉴定。方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态学特征。在成骨诱导剂作用下,通过碱性磷酸酶染色试剂盒行碱性磷酸酶染色,I型胶原免疫细胞化学染色,VonKossa法及茜素红进行矿化结节染色以及电镜下检测兔骨髓间充质干细胞成骨诱导后的形态结构。结果与结论：经诱导后细胞出现与成骨细胞相似的形态学特征,碱性磷酸酶染色阳性,I型胶原免疫细胞化学染色,Von-Kossa法及茜素红矿化结节染色阳性。表明经成骨诱导剂诱导后全骨髓贴壁法体外分离纯化培养的兔骨髓间充质干细胞能向成骨细胞方向分化增殖。     

特应性皮炎模型小鼠的生长繁殖及血液生理生化指标

背景：Nc/Nga小鼠皮损、病理和免疫学特征等均与人类特应性皮炎相一致,作为特应性皮炎动物模型其研究价值日益显现。目前国内尚无Nc/Nga小鼠的生理生化指标等相关数据报道。目的：观察特应性皮炎动物模型Nc/Nga小鼠的生长繁殖性能以及血液生理、生化指标。方法：统计Nc/Nga小鼠1-3胎的繁殖指标数据,包括每胎产仔数、离乳率、怀孕率及胎间隔。分别称取60只1-56 d Nc/Nga仔鼠的体质量,雌雄各半,绘制其生长表格。Nc/Nga鼠眼眶采血,测定其血常规和生化值。结果与结论：Nc/Nga 小鼠平均交配分娩间隔为(25.8±3.1) d,平均产仔数为(7.5±2.5)只,平均离乳率为(97.2±1.2)%、平均怀孕率为(97.0±1.4)%,1-3胎间差异无显著性意义(P>0.05)。Nc/Nga小鼠的体质量随着日龄的增长而逐渐增加,断奶后一两周内增重最为迅速,6周后体质量雌雄间差异无显著性意义(P>0.05)。同一日龄的雌雄间血常规和生化值比较,雌性小鼠红细胞、血红蛋白明显高于雄性小鼠;雄性小鼠血小板计数明显高于雌性小鼠(P <0.05);雌性小鼠三酰甘油、白蛋白水平明显高于雄性小鼠(P <0.05)。提示性别和年龄都会影响Nc/Nga小鼠的血液生理和生化值指标。     

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景：目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的：探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法：采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论：原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。     

体外贴壁和微囊化生长睾丸支持细胞形态与其功能的相关性

背景:细胞体外培养一直是研究活细胞的主要方法,但体外培养细胞的形态和生长环境与体内环境有很大差异,因此,细胞的生物活性是否能准确反映体内该细胞的状态尚不清楚。目的:观察体外培养细胞的形态与其生理功能间的相关性。方法:体外培养不同生长状态的小鼠睾丸支持细胞,一种为贴壁生长状态,细胞呈扁平状;另一种为微囊化生长状态,细胞呈立体球状。分别取2种不同形态睾丸支持细胞的培养液,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,获取相应的蛋白质条带,通过蛋白质相对分子质量的计算来确认睾丸支持细胞分泌蛋白质的种类。结果与结论:贴壁生长的扁平状的睾丸支持细胞培养液中可辨别出14个条带,蛋白质相对分子质量分布在(17～158)×103之间;微囊化生长的立体球状睾丸支持细胞培养液中可辨别出10个条带,蛋白质相对分子质量分布在(17～58)×103之间。提示不同形态的睾丸支持细胞在蛋白质分泌数量和种类上都存在着差异,细胞的形态与其生理功能之间存在着明显的相关性。