Fibroblast-derived exosomal miRNA-133 promotes cardiomyocyte-like differentiation

ObjectiveTo investigate the role of exosomal miRNA-133 secreted by cardiac fibroblasts (CFs) in promoting cardiomyocyte differentiation.MethodsNeonatal rat CFs were cultured in vitro, and the cultured CFs were divided into three groups as follows: induction, miRNA-133 high expression, and miRNA-133 inhibition. miRNA-133 was transfected into CFs with lentivirus as a vector. CFs were transfected with the miRNA-133 inhibitor, and the markers of cardiomyocyte were detected through immunofluorescence staining, Western blotting, and real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) at 3, 8, and 14 days, respectively. The expression levels of cardiac troponin T (cTnT) and cardiac actin (α-actin) were determined, and qRT-PCR was used to detect the expression of miRNA-133 in the fibroblast exosomes.ResultsCFs subjected to immunofluorescence staining expressed vimentin and discoid domain receptor 2. The exosomes secreted by CFs were observed as small vesicles of 30–100 nm via transmission electron microscopy, and Western blotting was used to detect exosome-specific protein CD63 and CD9 expression. The expression levels of cTnT, α-actin, and exosomal miRNA-133 secreted into the supernatant of the miRNA-133 high-expression group increased gradually at different time points and reached the highest level at 14 days. The expression levels of cTnT, α-actin, and exosome miRNA-133 in the miRNA-133 inhibition group were the lowest.ConclusionThe exosomal miRNA-133, which is derived from CFs, can promote the differentiation of fibroblasts into cardiomyocyte-like cells.     

血清miRNA-182检测在结直肠癌中的诊断价值研究

目的探讨血清miRNA-182作为结直肠癌(CRC)潜在标志物的诊断价值。方法运用荧光定量PCR法检测53例CRC患者血清miRNA-182相对表达量,并与肠良性病变患者及健康体检者进行比较分析。结果 CRC患者血清miRNA-182相对表达量明显高于肠良性病变组及对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。ROC曲线显示血清miRNA-182诊断CRC的曲线下面积为0.846,95%置信区间为0.768~0.925;诊断灵敏度为77.1%,特异度为81.1%。血清miRNA-182相对表达量与CRC患者TNM分期(P=0.011)及远距离转移(P=0.002)有关;而与其他临床特征无关。CRC患者术后血清miRNA-182相对表达量明显低于术前水平(P0.01);而术后出现复发/转移的患者血清miRNA-182相对表达量又明显升高(P=0.019)。结论 CRC患者血清miRNA-182相对表达量明显升高,并与病情及恶性进展密切相关,血清miRNA-182可作为CRC潜在标志物用于临床诊断及病情评估。     

EGF与miRNA-21联合构建雄激素非依赖性前列腺癌LNCaP亚细胞模型

目的构建雄激素非依赖性的人前列腺癌细胞株LNCaP亚型。方法前期常规RPMI 1640培养基培养LNCaP细胞,然后给予无酚红的RPMI 1640培养基,其中加入10%活性碳/葡聚糖处理的胎牛血清,细胞传代后将10μg/L表皮生长因子（EGF）加入培养基,50 nmol/L miRNA-21类似物转染细胞,长期培养。镜下观察细胞形态变化,MTT检测细胞增殖活性,RT-PCR检测雄激素受体基因扩增情况。结果细胞培养约2.5个月后,LNCaP细胞成功转变为非雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP亚细胞,细胞增殖能力升高,雄激素受体表达上调。结论体内雄激素依赖性前列腺癌可向雄激素非依赖性前列腺癌转变,而且miRNA-21和EGF对该转变起促进作用。     

miR-101在维吾尔族妇女子宫颈癌中的表达及其与COX-2的关系

目的研究miR-101与其靶基因环氧合酶-2(Cyclooxygenase,COX-2)在维吾尔族妇女慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤样病变Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ)及子宫颈癌组织中的表达,以探讨miR-101及其与COX-2的关系。方法应用锁定核苷酸原位杂交技术(LNA-ISH)检测维吾尔族妇女慢性宫颈炎、CINⅠ～Ⅲ和子宫颈癌组织中miR-101的表达情况;应用免疫组化Envision两步法检测COX-2在维吾尔族妇女慢性宫颈炎,宫颈上皮内瘤样病变Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及子宫颈癌组织中的表达情况,并进行相关性分析。结果 miR-101在慢性宫颈炎、CINⅠ～Ⅲ及子宫颈癌中的表达率分别为80%、72%、48%、24%和8%,差异具有统计学意义(χ2=37.828,P=0.000)。慢性宫颈炎组织中未见COX-2阳性表达;CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ以及子宫颈癌组织中COX-2阳性表达率分别为12%、36%、60%、84%,差异具有统计学意义(χ2=28.846,P<0.05)。miR-101与其靶基因COX-2呈负相关性(R=-0.997,P=0.000)。结论 miR-101与其靶基因COX-2可能与子宫颈癌的发病机制有关。     

HeLa细胞中miRNA-214靶基因Mek3的确定

目的 探索miRNA-214在HeLa细胞中的与其靶基因Mek3相互作用.方法 通过miRNA靶基因预测网站寻找可能与miRNA-214相互作用的靶基因,合成miRNA-214和对照序列,将miRNA-214、对照序列、Mek3的3'非翻译区(3' UTR)以及突变的Mek3 3'UTR分别克隆到表达载体上,转染HeLa细胞,转染48 h后提取蛋白,检测绿色荧光蛋白的表达水平; HeLa细胞转染miRNA-214后,Trizol抽提RNA,通过荧光定量PCR检测Mek3 mRNA的表达水平;Western印迹检测Mek3的蛋白表达水平.经过以上实验从mRNA和蛋白水平上验证了在HeLa细胞中miRNA-214对靶基因Mek3的作用效应.结果 生物信息学方法显示miRNA-214和Mek3存在可能的结合位点.经过实验验证了miRNA-214可以下调Mek3的mRNA和蛋白水平.结论 miRNA-214可以负调节靶基因Mek3的表达.     

反义miRNA-221/222上调p27kip1抑制胶质瘤细胞生长的体外研究

目的 探讨敲低miRNA-221/222表达上调p27kip1抑制U251人脑胶质瘤细胞株生长的效果及机制.方法 脂质体共转染反义miRNA-221/222下调U251人脑胶质瘤细胞株miRNA-221、miRNA-222的表达.使用Northern blot方法 鉴定转染后U251细胞miRNA-221、miRNA-222表达水平下调;MTT法评价反义miRNA-221/222抑制U251细胞生长效果;流式细胞术检测转染后U251细胞周期分布;Western blot分析p27kip1蛋白的表达变化.结果 Northern blot显示反义miRNA-221/222共转染组使miRNA-221、miRNA-222的表达水平明显下降.反义miRNA-221转染组仅使miRNA-221的表达水平明显下降,反义miRNA-222转染组仅使miRNA-222的表达水平明显下降.转染无意序列组及对照组的miRNA-221、miRNA-222表达水平没有改变.MTT结果 显示反义miRNA-221/222共转染组肿瘤细胞生长速度小于对照组、转染无意序列组、转染反义miRNA-221组、转染反义miRNA-222组.流式细胞术检测可见反义miRNA-221/222共转染组细胞周期存在G0/G1期阻滞且明显高于其他各组.Western blot显示反义miRNA-221/222共转染组的p27kip1蛋白表达明显上调.结论 反义miRNA-221/222通过上调p27kip1蛋白表达来抑制胶质瘤细胞U251的生长.     

miRNA-22在脂肪基质细胞体外脂向分化过程中的表达

背景：脂肪基质细胞在特定条件下可以向脂肪细胞分化, 然而,脂肪基质细胞脂向分化的分子机制仍不明确！ 目的：明确miRNA在脂肪基质细胞脂向分化过程中是否发挥作用及其可能机制。 设计、时间及地点：观察对照试验,于2007-10/2008-03在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。 材料：出生30 d健康雄性SD幼鼠8只,取出脂肪,采用密度梯度离心结合贴壁培养法获得了纯度高的脂肪基质细胞。 方法:采用脂向诱导液对第3代的脂肪基质细胞进行诱导培养。建立脂肪基质细胞体外脂向分化细胞模型,采用miRNA芯片技术筛选脂肪基质细胞向脂肪细胞方向分化的相关miRNA,使用实时定量聚合酶链反应技术对芯片结果进行验证。 主要观察指标：①细胞形态学。②PPARγ免疫细胞化学染色和油红O染色。③miRNA芯片结果。④实时定量聚合酶链反应结果。 结果: ①经显微镜下观察、油红O染色及PPARγ免疫细胞化学染色检测证实脂肪基质细胞已经脂向分化。②miRNA芯片发现诱导组中miRNA-22的表达量呈下降趋势。③实时定量聚合酶链反应结果证实miRNA-22的表达量与对照组相比显著减少(P < 0.05)。 结论: miRNA-22在脂肪基质细胞脂向分化后的表达有显著降低,提示miRNA-22可能参与脂肪基质细胞的脂肪分化调控过程,生物信息学分析提示,该过程可能通过对其靶基因MAPK7(ERK5)的调控而实现。     

miRNA-122a靶基因预测及生物信息学分析

目的:利用基因芯片技术分析肝癌HepG2细胞和正常肝上皮LO2细胞中miRNA的表达,并对HepG2细胞中低表达的miRNA-122a进行靶基因预测及相关生物信息学分析,为以miRNA-122a为靶点的基因治疗提供理论和实验基础.方法:利用基因芯片技术检测HepG2细胞和LO2细胞中miRNA-122a表达水平,通过生物信息学预测miRNA-122a的靶基因,并对其靶基因进行功能富集分析(GO-analysis)、信号转导通路富集分析(Pathway-analysis)和蛋白质相互作用网络分析.结果:与LO2细胞比较,miRNA-122a在HepG2细胞中呈低表达.miRNA-122a预测靶基因有1 104个,其靶基因集合功能分别富集于碳水化合物生物合成、核苷酸代谢、细胞因子受体结合、细胞周期等生物学过程(P<0.001);信号转导通路显著富集于JAK-STAT信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、ErbB信号通路、细胞周期等信号转导通路(P<0.001).结论:miRNA-122a在HepG2细胞中呈现低表达,miRNA-122a预测靶基因集合显著富集在与肿瘤发生相关的信号通路中.     

miRNA-21与肿瘤相关研究新进展

小RNA(microRNA,miRNA)是近年发现的一类内源性非编码单链RNA,在转录后水平对基因表达发挥负调控作用,参与细胞生长、发育、凋亡等重要生物过程.研究发现miRNA-21在肿瘤的发生发展过程中扮演着非常重要的角色,在不同类型肿瘤中的表达均出现明显上升,与肿瘤细胞的增殖、侵袭、血管的生成和抗药性等生物学行为相关.本文将从miRNA-21的表达与定位、对靶基因的调控以及对miRNA-21的转录调控等方面进行综述.