基于多重PCR技术检测蜡样芽胞杆菌3种毒素基因方法的建立及评价

目的 基于多重PCR技术,建立一种快速检测蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM 3种毒素基因的方法,并评价其效能。 方法 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,以蜡样芽胞杆菌nhe、cytK和entFM特异性毒素基因作为靶基因,采用NCBI primer-BLAST 5.0软件设计特异性引物,优化反应体系。建立三重PCR检测体系,并检测其特异性、灵敏度和稳定性。 结果 煮沸法提取蜡样芽胞杆菌DNA,浓度为227 mg·L^－1,纯度为1.50~1.60。采用多重PCR体系同时检测蜡样芽胞杆菌3种毒素致病基因,于退火温度56 ℃时,蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499的扩增片段为499 bp,基因引物cytK191的扩增片段为191 bp,基因引物entFM363的扩增片段为363 bp。PCR体系扩增蜡样芽胞杆菌3种毒素基因后条带清晰明亮,且无非特异性条带,与金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌均无扩增,表明蜡样芽胞杆菌基因引物nhe499、cytK191和entFM363特异性强;3种引物在同一反应体系中互不干扰。灵敏度检测,多重PCR体系最低检测限可同时达到10^－1 mg·L^－1;稳定性检测,多重PCR体系自制备起每6个月检测稳定性一致。 结论 建立的多重PCR检测体系对于蜡样芽胞杆菌nhe499、cytK191和entFM363 3种毒素基因灵敏度高、特异性强,检测结果准确稳定,检测体系具有良好稳定性,适用于快速检出蜡样芽胞杆菌的3种不同致病毒素基因。     

钙调素ELISA定量检测方法的建立与实验条件优化

目的 研究ELISA法定量测定钙调素(CaM)的最优条件。方法 用重组人CaM、免抗CaM，通过对聚苯乙烯反应板进行紫外辐照处理，改善抗原因相化条件；通过对抗原包被液、包被时间等条件优化，建立简便、快速、准确的ELISA定量技术。结果 以pH7．4 0．01mol/L的PB为包被液，包被及后续封闭时间为4℃静置72h，CaM包被浓度为5-8g/ml，抗原抗体反应时间为37℃ 60min，可获最佳CaM定量结果。结论 建立的检测CaM的ELISA测定方法，敏感性、重复性均在临床检测可接受的范围内，标准曲线的线性也较好，可用于细胞内外CaM的定量研究。     

酶双循环法测定一氧化氮合酶活性实验条件探讨

目的运用Wang法与酶双循环法联合测定血清中一氧化氮合酶（NOS）活性。方法先改良Wang法测定NOS活性的实验条件，再探讨Wang法与酶双循环法偶联的实验条件，比较酶双循环前后检测物性质。结果总NOS（tNOS）测定试剂由20mmol／L L-精氨酸、25μmol／L还原型辅酶Ⅱ（NADPH＋H^＋）、50．0μmol／LCaCl2、45．0μmol／L二硫苏糖醇（DTT）、36．0μmol／L乙二胺四乙酸（EDTA）、1．8μmol／L苯甲磺酰氯（PMSF）、80μmol／L尼克酰胺、1μg／ml钙调蛋白（CalM）和10μg/ml蛋白酶抑制剂Antipain组成。以上试剂添加诱导性NOS（iNOS）抑制剂N^W-硝基-D-精氨酸用于测定结构型NOS（cNOS）。对NOS生成的氧化型辅酶Ⅱ（NADP^＋）采用酶双循环产物6-磷酸葡萄糖酸（6PG）脱氢生成的大量NADPH＋H^＋，其放大倍数约为70～80倍。结论酶双循环法提高了测定NOS的灵敏度。     

分析灵敏度（检测限）

为了加强读者、作者和编者间的沟通 ,从本期起本刊将不定期增加一个编者短评。对近年来检验人员共同关心的有关问题作一些评论 ,诸如 :分析灵敏度、参考值和参考区间、病人结果可报告范围、判断限的确定、标准品和校准品、统计在检验中应用的意义等。以此对读者在总结工作、阅读文献或讨论交流时有帮助。恳切希望关心检验事业的朋友们对本刊提出建议、批评。本期对分析灵敏度的含义和实验方法做了介绍。     

泌尿生殖道溶脲脲原体感染及耐药分析

目的了解重庆涪陵地区泌尿生殖道溶脲脲原体感染及耐药情况，以指导临床合理用药。方法采用支原体培养、鉴定、药敏一体化试剂盒对771例泌尿生殖道感染患者进行支原体培养及药敏试验。结果检出溶脲脲原体阳性率49．9％，男性占12．5％，阳性率22．3％；女性占87．5％，阳性率60．6％。溶脲脲原体感染主要集中在21～40岁年龄段人群。对溶脲脲原体灵敏度最高的抗生素是克拉霉素95.12％，其次是强力霉素87．57％，罗红霉素86．24％。结论各地区间溶脲脲原体药敏结果差别较大，必须依据药敏结果选药。克拉霉素、强力霉素、罗红霉素可作为本地区治疗溶脲脲原体首选药物。大观霉素、林可霉素耐药现象严重。     

使用MA-4210尿分析仪体会

尿分析仪为尿液检验向自动化迈进一步，它提供了定性检验和半定量结果。有利于临床疾患程序的分析，同时尿分析仪灵敏度较化学法尿液分析灵敏度高，有利于疾病的早期诊断。     

PCR技术检测的质控问题经验谈

ＰＣＲ技术检测的质控问题经验谈丁柳秦山华西医科大学附属第一医院传染科聚合酶链反应（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是一种选择性体外扩增核酸片段的方法，自从１９８４年Ｍｕｌｉｓ发明该技术后，取得了突飞猛进的发展，已在临床检测如感...     

STEADI跌倒风险自评量表在社区老年人中的应用研究

目的应用STEADI跌倒风险自评量表筛查社区老年人跌倒风险,并了解其对老年人远期跌倒的预测效能。方法采用多阶段整群随机抽样,选取重庆市社区老年人1 168人,运用汉化版STEADI跌倒风险自评量表筛查其跌倒风险。6个月后电话随访老年人跌倒发生情况。结果 321人(27.5%)自评有跌倒风险。6个月后有效电话随访825人,64人发生跌倒,跌倒发生率为7.8%(64/825),跌伤率为71.9%(46/64)。汉化版预测6个月后社区老年人发生跌倒的灵敏度为45.3%,特异性为75.4%,AUC为0.604,约登指数为0.208。71.6%的老年人认为跌倒风险自我评估对其有意义,69.9%的老年人评估后实施了预防跌倒的相关措施。结论大多数老年人认可跌倒风险自评的意义并采取相关措施预防跌倒,但汉化版预测社区老年人6个月后发生跌倒的效能欠佳,建议结合步态、力量和平衡的评估结果来预测老年人跌倒风险。